本文關(guān)鍵詞：新型隱球菌FQ-PCR檢測體系在血流感染大鼠模型的應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：通過構(gòu)建的新型隱球菌血流感染大鼠模型,運用本課題前期研究建立的實時熒光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)檢測體系,對不同時間段新型隱球菌血流感染大鼠的血液、肺泡灌洗液、腦脊液標本分別進行FQ-PCR、血培養(yǎng)、血清莢膜抗原檢測,比較各檢測方法的敏感性和特異性,為臨床應(yīng)用新型隱球菌FQ-PCR檢測提供實驗室依據(jù)。方法：1.將60只雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,SPF級,6-8周,體重200±20g,隨機分為4組,分別為A組免疫抑制感染組(n=20只),B組正常狀態(tài)感染組(n：20),C組免疫抑制對照組(n=10),D組正常對照組(n=10)；四組中奇數(shù)編號大鼠在0、12、48h,偶數(shù)編號大鼠在6、24、72h分別各留取全血2.5ml。A組和C組大鼠實驗第一天一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺(150mg/kg), B組和D組腹腔注射等量1ml生理鹽水；實驗第4天A組和B組根據(jù)預(yù)實驗的最佳新型隱球菌菌懸液濃度1×10。菌懸液尾靜脈注射1ml,C組和B組注射等量的1ml生理鹽水。2.在實驗第4天大鼠感染模型建立成功后,從大鼠眼內(nèi)側(cè)靜脈叢按奇偶編號分別采集3個時間段的血液標本,離心分離和收集血漿樣品,-20℃保存待測。采血時間分別為0、6、12、24、48、72h。實驗第6天大鼠全部處死,無菌操作下,收集4組大鼠的肺泡灌洗液、腦脊液,-20℃保存待測；同時取肺、肝、脾、腦組織和用10%的甲醛溶液固定過夜,石蠟切片下常規(guī)HE染色、PAS染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。3.提取大鼠血漿、肺泡灌洗液、腦脊液標本的DNA,用前期建立的熒光定量PCR方法對分別對不同時間段感染的血標本、腦脊液及肺泡灌洗液進行檢測,并同時進行培養(yǎng)方法、組織病理、墨汁染色、莢膜凝集實驗,比較4種不同方法檢測的結(jié)果。結(jié)果：1.通過環(huán)磷酰胺免疫抑制尾靜脈注射新型隱球菌感染的大鼠模型,易出現(xiàn)系統(tǒng)性的感染,包括肺、腦、脾、肝組織的感染,不僅解剖肉眼發(fā)現(xiàn),肺臟出現(xiàn)多發(fā)性結(jié)節(jié)樣改變,并且各組織病理的PAS染色均發(fā)現(xiàn)大量圓形或卵圓形隱球菌體,證實血流感染大鼠建模成功。2.A組血培養(yǎng)結(jié)果最高達30%,四組之間陽性率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。A組莢膜抗原法的陽性率可達(80%),在48小時后檢測陽性率高于B、C、D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.新型隱球菌FQ-PCR檢測體系A(chǔ)組血漿12h后的陽性率與B、C、D組相比較,檢測陽性率高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且對于血液標本來說,FQ-PCR檢測方法的陽性率明顯優(yōu)于血培養(yǎng)及血清莢膜抗原法,而且可以定量,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.新型隱球菌FQ-PCR檢測體系可檢測出肺泡灌洗液標本中的病原體,高于培養(yǎng)、墨汁染色陽性檢出率,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.新型隱球菌FQ-PCR檢測體系可檢測出腦脊液標本中的病原體,高于墨汁染色陽性檢出率,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1.通過環(huán)磷酰胺免疫抑制尾靜脈注射隱球菌菌懸液能成功構(gòu)建大鼠血流感染動物模型；2.新型隱球菌FQ-PCR反應(yīng)體系能檢測出感染大鼠血液中的病原菌,在72小時內(nèi)隨著感染時間的延長,陽性率逐漸上升,其敏感性高于血培養(yǎng)、血清莢膜抗原檢測；3.新型隱球菌FQ-PCR檢測方法較血培養(yǎng)及血清莢膜抗原檢查更早檢測到感染大鼠血液中的病原菌；4.新型FQ-PCR體系能檢測到大鼠肺泡灌洗液及腦脊液中病原菌。
【關(guān)鍵詞】：實時熒光定量PCR 動物模型 新型隱球菌 檢測 鼠
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R519.4
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 引言12-16
• 1 材料與方法16-24
• 1.1 實驗的材料16-17
• 1.2 實驗儀器17-18
• 1.3 研究方法18-23
• 1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法23-24
• 2 結(jié)果24-37
• 2.1 血流感染動物模型結(jié)果24-29
• 2.2 四種方法檢測結(jié)果29-37
• 討論37-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻43-50
• 綜述50-61
• 參考文獻55-61
• 主要英文縮寫詞表61-62
• 在讀期間發(fā)表的主要學(xué)術(shù)論文及參與課題62-63
• 致謝63-64

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