本文關鍵詞：骨化三醇對UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維化抑制作用及其對內(nèi)皮細胞參與纖維化調(diào)控作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：通過觀察骨化三醇對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化抑制作用和內(nèi)皮細胞TGF-β1、ICAM-1、HIF-1α、VEGF、VEGFR-2基因和蛋白水平表達的影響，從內(nèi)皮細胞角度探討骨化三醇對腎間質(zhì)纖維化的抑制作用機制。 方法： 1通過體內(nèi)試驗觀察骨化三醇對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化抑制作用。 1.1用180只清潔6周齡雄性SD大鼠，建立UUO模型。將動物分為五組（每組36只）：①UUO空白對照組；②手術對照組；③UUO+骨化三醇高劑量組；④UUO+骨化三醇低劑量組；⑤UUO+貝那普利組。手術當天給藥，每天給藥1次，UUO+骨化三醇高、低劑量組分別給予骨化三醇6ng/100g、3ng/100g溶于1mL橄欖油灌胃，UUO+貝那普利組將鹽酸貝那普利片0.17mg/100g溶于1mL生理鹽水灌胃；UUO對照組將左側輸尿管結扎后縫合；手術對照組和UUO組每天僅用1mL生理鹽水灌胃；并于第1、3、5、7、10、14天每組處死6只大鼠，留取標本。 1.2取梗阻側腎臟采用HE染色法觀察10，14天組腎組織病理變化，天狼腥紅染色法觀察14天組腎纖維化病理改變。 1.3ELISA法檢測7,10,14天組大鼠血清TNF-α表達水平。 1.4采用RT-PCR和western blot法觀察7,10,14天組轉化生長因子(TGF-β1)、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）mRNA和蛋白的表達。 1.5采用Western Blot法觀察1,3,5天組血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR-2）、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）蛋白的表達。 2通過細胞學試驗探討骨化三醇對內(nèi)皮細胞參與纖維化病理變化的影響。 2.1內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)：①人內(nèi)皮細胞株(Eahy926)，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，至Eahy926細胞生長成單層后備用。將Eahy926細胞分為5組：①氯化鈷刺激組；②空白對照組；③氯化鈷+骨化三醇高劑量組（終濃度為10-8mol/L）；④氯化鈷+骨化三醇中劑量組（終濃度為10-9mol/L）；⑤氯化鈷+骨化三醇低劑量組（終濃度為10-10mol/L）。 2.2采用MTT法測定骨化三醇對氯化鈷刺激的Eahy926細胞增殖作用的影響。 2.3采用ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中VEGF表達水平。 2.4用RT-PCR、Western Blot法測定骨化三醇對Eahy926細胞的影響。RT-PCR法測定VEGF,VEGFR-2,HIF-1α和ICAM-1mRNA表達水平,Western Blot法測定VEGFR-2,HIF-1α,ICAM-1蛋白的相對含量。 2.5采用流式細胞術檢測各實驗組內(nèi)皮細胞凋亡率。 3數(shù)據(jù)資料用(±SD)表示。 結果： 1骨化三醇對腎纖維化模型大鼠腎臟病理的改變的影響 UUO術后，各時間點大鼠表現(xiàn)不同程度的梗阻側腎臟腫大，腎皮質(zhì)變薄，腎盂腎盞增大。手術對照組大鼠腎臟無明顯改變，HE染色觀察各UUO組顯示腎小管間質(zhì)中炎癥細胞增多，腎小管細胞不同程度的變性、萎縮及壞死，骨化三醇高、低劑量組和貝那普利陽性對照組腎臟病變程度輕于同一時間點UUO組。天狼腥紅染色觀察UUO組大鼠腎間質(zhì)膠原產(chǎn)生增多，各藥物治療組大鼠腎間質(zhì)膠原減少，手術對照組大鼠腎間質(zhì)膠原無明顯增加。 2骨化三醇對UUO術后7,10,14天組大鼠血清TNF-α水平的影響 各藥物治療組和UUO組TNF-α濃度較手術對照組升高(P0.05)。隨著梗阻時間的延長，TNF-α的表達有上升的趨勢，高低劑量骨化三醇和貝那普利可以降低UUO大鼠血清TNF-α的濃度(P0.05)。 3骨化三醇對UUO術后7,10,14天組大鼠腎組織TGF-β1,ICAM-1mRNA和蛋白水平的影響 各藥物治療組和UUO組TGF-β1,ICAM-1mRNA和蛋白表達較手術對照組升高(P0.05)，且隨著梗阻時間的延長表達量上升，骨化三醇高低劑量和貝那普利可以明顯降低同時間點UUO大鼠TGF-β1,ICAM-1蛋白和mRNA的表達(P0.05)。 4骨化三醇對UUO術后1,3,5天組大鼠腎組織HIF-1α,VEGF,VEGFR-2蛋白水平的影響 4.1骨化三醇對UUO術后1,3,5天組大鼠腎組織HIF-1α蛋白水平的影響 各藥物治療組和UUO組HIF-1α蛋白表達較手術對照組升高(P0.05)，且隨著梗阻時間的延長保持相對穩(wěn)定，骨化三醇高低劑量和貝那普利可以明顯降低UUO大鼠HIF-1α蛋白的表達(P0.05)。 4.2骨化三醇對UUO術后1,3,5天組大鼠腎組織VEGF蛋白水平的影響 骨化三醇高低劑量和貝那普利可以明顯升高同時間點UUO大鼠VEGF蛋白的表達(P0.05)，但隨著梗阻時間的延長表達有下降趨勢。 4.3骨化三醇對UUO術后1,3,5天組大鼠腎組織VEGFR-2蛋白水平的影響 各UUO組VEGFR-2蛋白表達較手術對照組升高不明顯(P0.05)。骨化三醇高低劑量和貝那普利可以明顯升高同時間點UUO大鼠VEGFR-2蛋白的表達(P0.05)。但隨著梗阻時間的延長表達有下降趨勢。 5不同濃度骨化三醇對氯化鈷誘導的Eahy926細胞增殖的影響 當骨化三醇終濃度升至10-9mol/L，細胞生長增殖最明顯，與氯化鈷刺激組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 6骨化三醇對氯化鈷誘導的Eahy926細胞上清中VEGF的表達的影響 各藥物治療組和氯化鈷刺激組VEGF濃度較空白對照組升高(P0.05)，骨化三醇各劑量組與氯化鈷刺激組相比VEGF均升高(P0.05)，且當骨化三醇終濃度為10-9mol/L時VEGF表達最明顯。 7骨化三醇對氯化鈷誘導的Eahy926細胞VEGF,HIF-1α,VEGFR-2,ICAM-1, mRNA水平的影響 氯化鈷刺激組HIF-1α,ICAM-1mRNA的表達較空白對照組升高(P0.05)。骨化三醇作用24h之后，Eahy926細胞中HIF-1α,ICAM-1的表達受到抑制，與氯化鈷刺激組相比(P0.05)）。而VEGF,VEGFR-2的表達較氯化鈷刺激組升高(P0.05)。 8骨化三醇對氯化鈷誘導的Eahy926細胞產(chǎn)生VEGFR-2,HIF-1α,ICAM-1蛋白水平的影響 氯化鈷刺激組HIF-1α、ICAM-1蛋白表達與空白組相比明顯升高(P0.05)，，VEGFR-2與空白對照組相比升高不明顯(P0.05)。經(jīng)過骨化三醇作用24h之后，各組HIF-1α、ICAM-1蛋白表達受到抑制，與氯化鈷刺激組相比(P0.05)；而VEGFR-2蛋白的表達較氯化鈷刺激組相比顯著升高(P0.05)。 9不同劑量骨化三醇對經(jīng)氯化鈷誘導的Eahy926細胞凋亡的影響經(jīng)氯化鈷刺激24h后，氯化鈷刺激組細胞凋亡率明顯升高與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。經(jīng)過不同劑量骨化三醇作用24h之后，Eahy926細胞凋亡率明顯下降，與氯化鈷刺激組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論： 1骨化三醇具有抑制UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用。 2骨化三醇對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的抑制作用可能與其上調(diào)UUO大鼠腎組織中VEGF,VEGFR-2蛋白的表達，降低HIF-1α,ICAM-1,TGF-β1的表達有關，通過影響上述纖維化相關細胞因子的表達，減輕腎小管周圍毛細血管的破壞，減少腎小管上皮細胞的轉分化和成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)，從而減輕腎間質(zhì)纖維化。 3骨化三醇使氯化鈷處理的Eahy926細胞VEGF,VEGFR-2表達升高，HIF-1α,ICAM-1表達下降（與骨化三醇對UUO大鼠纖維化腎組織中上述分子表達的影響一致），并顯示能夠降低內(nèi)皮細胞凋亡率。提示骨化三醇可能通過影響內(nèi)皮細胞纖維化相關細胞因子、受體及粘附分子表達，抑制局部炎癥反應、保護腎臟毛細血管網(wǎng)及腎小管上皮細胞、間接減少局部TGF-β1水平，發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用。本結果揭示了骨化三醇通過內(nèi)皮細胞途徑發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用的部分機制。
【關鍵詞】：骨化三醇 腎間質(zhì)纖維化 Eahy926 細胞 VEGF VEGFR-2 TGF-β1 ICAM-1 HIF-1α
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R692
【目錄】：

• 目錄3-4
• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-30
• 結果30-37
• 附圖37-67
• 附表67-73
• 討論73-77
• 結論77-78
• 參考文獻78-82
• 綜述 VEGF 與缺血性疾病82-90
• 參考文獻87-90
• 致謝90-91
• 個人簡歷91

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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  本文關鍵詞：骨化三醇對UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維化抑制作用及其對內(nèi)皮細胞參與纖維化調(diào)控作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：332035