本文關(guān)鍵詞：CIB1在VEGF誘導(dǎo)的MSCs成血管分化過程中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 1.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定。 2. CIB1在VEGF誘導(dǎo)的MSCs成血管分化過程中的作用研究。 方法： 1．取剖宮產(chǎn)足月新生兒臍帶，在無菌超凈工作臺(tái)中采用組織貼壁法分離提取原代hUC-MSCs用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)hUC-MSCs的免疫表型和周期進(jìn)行檢測(cè)，取第3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)進(jìn)行成脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。 2．本實(shí)驗(yàn)以hUC-MSCs為對(duì)象，應(yīng)用構(gòu)建好的CIB1慢病毒載體對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分四組，正常hUC-MSCs誘導(dǎo)組；CIB1慢病毒載體轉(zhuǎn)染hUC-MSCs誘導(dǎo)組，此組又分為NC感染誘導(dǎo)組、pGV-siCIB1感染誘導(dǎo)組；空白對(duì)照組，，即正常hUC-MSCs空白對(duì)照。首先，進(jìn)行合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組確定最適的慢病毒感染復(fù)數(shù)MOI。采用MTT的實(shí)驗(yàn)方法觀察CIB1慢病毒載體轉(zhuǎn)染hUC-MSCs后細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀對(duì)各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期進(jìn)行獲取。應(yīng)用基質(zhì)膠上三維血管形成實(shí)驗(yàn)和Dil-ac-LDL的吸收實(shí)驗(yàn)使各組細(xì)胞的成血管能力得以檢測(cè)，最后應(yīng)用細(xì)胞爬片的免疫熒光技術(shù)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物CDH5、CD34和FLK-1的基因表達(dá)進(jìn)行鑒定。 結(jié)果： 1.成功分離提取hUC-MSCs，流式細(xì)胞儀測(cè)定發(fā)現(xiàn)其幾乎全部都處于分化前階段，可以很好分化生長(zhǎng)。細(xì)胞表面標(biāo)記測(cè)定發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs高表達(dá)CD29，陽性率達(dá)92.62㳠；高表達(dá)CD44和CD105，陽性率分別為88.83㳠和91.87㳠；高表達(dá)CD130，92.45㳠； CD45低表達(dá)，1.46㳠，低表達(dá)HLA-DR，2.06㳠。對(duì)其多想分化能力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其可以分化為脂肪細(xì)胞，油紅O染色陽性，并表達(dá)該細(xì)胞特定的細(xì)胞標(biāo)志LPL和Leptin。 2.成功地對(duì)CIB1抑制表達(dá)的慢病毒載體感染hUC-MSCs的MOI進(jìn)行測(cè)定，最適MOI為20。完成感染以后細(xì)胞周期以及細(xì)胞生存活性的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)感染后G2/M期pGV-siCIB1感染組細(xì)胞所占比例較NC感染組明顯升高。說明RNAi下調(diào)CIB1表達(dá)使細(xì)胞阻滯在G2/M期。MTT結(jié)果顯示，pGV-siCIB1感染組細(xì)胞的生存活性明顯下降，NC感染組變化不明顯。進(jìn)行成血管內(nèi)皮細(xì)胞的條件誘導(dǎo)21天發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)其類似于血管內(nèi)皮細(xì)胞樣的管腔結(jié)構(gòu)明顯增加，到21天時(shí)幾乎布滿顯微鏡下整個(gè)視野，在基質(zhì)膠上同樣也出現(xiàn)三維的管腔結(jié)構(gòu)，對(duì)乙酰標(biāo)記的人低密度脂蛋白的吸收以較誘導(dǎo)前大幅度增大，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)記CD34、CDH5和FLK-1與誘導(dǎo)前的陰性結(jié)果不一樣，出現(xiàn)陽性表達(dá)。不但形態(tài)與血管內(nèi)皮細(xì)胞一樣，其細(xì)胞活性以及細(xì)胞表面表達(dá)的標(biāo)記都與血管內(nèi)皮細(xì)胞一致。而CIB1抑制表達(dá)組則不會(huì)發(fā)生上述變化，既沒有管腔結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，也不表達(dá)小血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD34，血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CDH5和FLK-1。對(duì)Dil-ac-LDL的吸收也沒有增加�？蛰d體組誘導(dǎo)后實(shí)驗(yàn)結(jié)果過與正常hUC-MSCs誘導(dǎo)后的結(jié)果幾乎一致，證明了CIB1在hUC-MSCs在分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的過程中起了重要的作用。 結(jié)論： 1．成功提取分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并對(duì)其表型進(jìn)行鑒定分析，為后期實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。 2．CIB1在VEGF誘導(dǎo)MSCs成血管分化中分子通道上起著重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 CIB1 血管分化
【學(xué)位授予單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語表10-11
• 前言11-13
• 第一章 HUC MSCS 的分離、培養(yǎng)、鑒定和誘導(dǎo)分化研究13-23
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器13-14
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑13
• 1.1.3 主要儀器13
• 1.1.4 常用試劑的配制13-14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法14-18
• 1.2.1 hUC-MSCs 原代細(xì)胞的分離提取14-15
• 1.2.2 流式細(xì)胞儀對(duì) hUC-MSCs 的表型檢測(cè)15
• 1.2.3 流式細(xì)胞儀對(duì) hUC-MSCs 的周期檢測(cè)15
• 1.2.4 hUC-MSCs 成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化15-18
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析18
• 1.4 結(jié)果18-20
• 1.4.1 hUC MSCs 原代細(xì)胞的提取培養(yǎng)及形態(tài)觀察18
• 1.4.2 流式細(xì)胞儀對(duì) hUC-MSCs 的表型檢測(cè)18-19
• 1.4.3 流式細(xì)胞儀對(duì) hUC-MSCs 的周期檢測(cè)19
• 1.4.4 hUC-MSCs 成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化19-20
• 1.5 討論20-22
• 1.6 結(jié)論22-23
• 第二章 CIB1 在 VEGF 誘導(dǎo)的 HUC MSCS 成血管分化過程中的作用研究23-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器23-24
• 2.1.1 主要材料與試劑23
• 2.1.2 主要儀器23-24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)常用實(shí)際的配制24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 2.2.1 pGV-siCIB1 感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞最適感染復(fù)數(shù)（MOI）的確定24-25
• 2.2.2 pGV-siCIB1 體外感染 hUC-MSCs25
• 2.2.3 pGV-siCIB1 體外感染 hUC-MSCs 后 CIB1 沉默效應(yīng)在蛋白水平的體現(xiàn)25-27
• 2.2.4 流式法測(cè) pGV-siCIB1 體外感染 hUC-MSCs 后的細(xì)胞周期27-28
• 2.2.6 VEGF 和 bFGF 條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)28-29
• 2.2.7 Matrigel 基質(zhì)膠上血管形成實(shí)驗(yàn)29
• 2.2.8 Dil-Ac-LDL 的吸收實(shí)驗(yàn)29
• 2.2.9 細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)29-30
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析30
• 2.4 結(jié)果30-37
• 2.4.1 pGV-siCIB1 體外感染 hUC-MSCs 最適 MOI 的確定30-31
• 2.4.2 pGV-siCIB1 體外感染 hUC-MSCs 后 CIB1 沉默效應(yīng)在蛋白水平的體現(xiàn)31
• 2.4.3 流式法測(cè) pGV-siCIB1 體外感染 hUC-MSCs 后的細(xì)胞周期31-32
• 2.4.4 MTT 法流式法測(cè) pGV-siCIB1 體外感染 hUC-MSCs 后的細(xì)胞活性32-33
• 2.4.5 VEGF 和 bFGF 條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)33-34
• 2.4.6 Matrigel 基質(zhì)膠上血管形成實(shí)驗(yàn)34
• 2.4.7 Dil-Ac-LDL 的吸收實(shí)驗(yàn)34-35
• 2.4.8 細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)35-37
• 2.5 討論37-39
• 2.6 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 致謝44-45
• 附錄45-52
• 綜述52-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 作者簡(jiǎn)歷與攻讀學(xué)位期間取得的研究成果61

【參考文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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  本文關(guān)鍵詞：CIB1在VEGF誘導(dǎo)的MSCs成血管分化過程中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：330040