目的：從大鼠胎肝組織克隆GPC3基因,成功構(gòu)建帶綠色熒光蛋白報告基因的大鼠真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/GPC3N48-EGFP-GPC3C550,為深入研究GPC3的功能和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：①根據(jù)已知的大鼠GPC3基因序列,設(shè)計相關(guān)引物,分析pGEM-T質(zhì)粒、骨架質(zhì)粒pcDNA3.1（+）和pGEM-T/EGFP質(zhì)粒的酶切位點,在相應(yīng)引物兩端引入適合的限制性內(nèi)切酶位點。②提取大鼠胎肝組織總RNA,采用RT-PCR方法擴增包含全長GPC3的基因片段,連入pGEM-T載體,經(jīng)過藍(lán)白篩選,挑細(xì)菌克隆。經(jīng)菌液PCR及測序鑒定,得到pGEM-T/RGPC3-Long質(zhì)粒。③以pGEM-T/GPC3R-Long質(zhì)粒為基礎(chǔ),應(yīng)用相應(yīng)的引物依次構(gòu)建帶有全長GPC3基因的pGEM-T/GPC3ORF質(zhì)粒、截短的GPC3-N端pGEM-T/GPC3N48質(zhì)粒和GPC3-C端pGEM-T/GPC3C550質(zhì)粒。④上述質(zhì)粒和已保存的pGEM-T/EGFP質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化,依次將基因片段GPC3-N48、EGFP和GPC3-C550插入到pcDNA3.1（+）中,構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白的大鼠真... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
Abstract
摘要
目錄
符號說明
1 前言
2 材料和方法
    2.1 標(biāo)本來源
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗試劑與試劑盒
        2.2.2 實驗儀器
        2.2.3 引物設(shè)計與合成
    2.3 實驗方法
        2.3.1 pGEM-T/GPC3 R-Long表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
        2.3.2 pGEM-T/GPC3R ORF表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
        2.3.3 截短型pGEM-T/GPC3N_(48)和pGEM-T/GPC3C_(550)表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
        2.3.4 pcDNA3.1(+)/GPC3N_(48)-EGFP-GPC3C_(550)的嵌合
3 實驗結(jié)果
    3.1 pGEM-T/GPC3 R-Long表達(dá)載體
        3.1.1 總RNA的提取
        3.1.2 RT-PCR結(jié)果
        3.1.3 藍(lán)白斑篩選結(jié)果
        3.1.4 菌液PCR驗證
        3.1.5 測序分析
    3.2 pGEM-T/GPC3 ORF表達(dá)載體
        3.2.1 PCR結(jié)果
        3.2.2 菌液PCR驗證
        3.2.3 測序分析
    3.3 截短型pGEM-T/GPC3N_(48)和pGEM-T/GPC3C_(550)表達(dá)載體
        3.3.1 PCR結(jié)果
    3.4 真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/GPC3N_(48)-EGFP-GPC3C_(550)的嵌合
        3.4.1 pcDNA3.1(+)/GPC3C_(550)載體的構(gòu)建和酶切鑒定
        3.4.2 pcDNA3.1(+)/GPC3 N_(48)-EGFP-GPC3C_(550)的鑒定
4 討論
5 結(jié)論
本課題創(chuàng)新性研究以及不足
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3298312