發(fā)布時間：2017-04-26 21:02

  本文關(guān)鍵詞：胚胎干細胞向脂肪細胞分化過程中蛋白糖基化變化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)具有多潛能性及自我更新的能力,對于研究細胞分化而言是一類十分有效的材料。與ESCs相似,孤雌胚胎干細胞(parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs)同樣具有這些特性,ESCs與pESCs均具有向脂肪細胞分化的潛能,因此研究胚胎干細胞向脂肪細胞分化過程的分子機制對治療肥胖相關(guān)疾病至關(guān)重要。近年來,胚胎干細胞向脂肪細胞分化的過程已在基因和蛋白水平被廣泛研究,但其過程中蛋白糖基化的變化尚不清楚。實驗?zāi)康模?研究胚胎干細胞(ESCs)J1和孤雌胚胎干細胞(pESCs)向脂肪細胞分化過程中蛋白糖基化的變化情況并比較其差異。方法和結(jié)果： 1.通過細胞形態(tài)學(xué)觀察,免疫熒光檢測干細胞標志蛋白(OCT4,NANOG,SSEA-1)的表達,畸胎瘤形成及細胞活力(wst-1),比較J1ESCs和pESCs在體內(nèi)、外分化潛能及細胞增殖活性。結(jié)果顯示,J1ESCs和pESCs均保持高度的全能性,細胞增殖能力無顯著性差異(p0.05)。 2.通過茜素紅、番紅O、油紅O染色及RT-PCR檢測骨細胞(ocn和alp)、軟骨細胞(agg和col Ⅱ)、脂肪細胞(ppar γ和fabp4)特異性基因的表達,研究J1ESCs和pESCs成骨、成軟骨及成脂能力。結(jié)果顯示,J1ESCs和pESCs均具有向骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞分化的潛能。 3.通過油紅O染色陽性率、免疫熒光檢測脂肪細胞特異性蛋白(C/EBP α和FABP4)的表達、qPCR檢測脂肪細胞特異性基因(ppar γ, fabp4和c/ebp α)及干細胞特異性基因(oct4)的表達水平,比較J1ESCs和pESCs向脂肪細胞分化的能力。結(jié)果顯示,誘導(dǎo)20d后,J1ESCs和pESCs油紅O細胞陽性率分別為60%±6.4%和42%±6.9%(p0.05),C/EBP α和FABP4蛋白在pESCs誘導(dǎo)5d后均不表達,而在J1ESCs誘導(dǎo)5d后均表達陽性。ppar γ, fabp4和c/ebp α基因在J1ESCs向脂肪誘導(dǎo)過程中變化倍數(shù)均顯著高于pESCs(p0.05).oct4在ESCs和pESCs中表達量均顯著下降(p0.05)。 4.通過凝集素芯片技術(shù)及凝集素組化技術(shù)比較J1ESCs和pESCs在脂肪誘導(dǎo)過程中蛋白糖基化的變化。結(jié)果顯示,在37種凝集素中,誘導(dǎo)第20d, J1ESCs和pESCs中有21種凝集素展現(xiàn)出相同的變化,其中7種上升,12種下降,2種無顯著變化。37種凝集素中,兩種胰島素樣活性凝集素在J1ESCs和pESCs中表現(xiàn)出不同的變化趨勢。誘導(dǎo)后,WGA(識別多價唾液酸和G1cNAc)在J1ESCs和pESCs中均上調(diào),ConA(識別分支和末端的甘露糖及末端的G1cNAc)的信號值在J1ESCs中上調(diào),在pESCs中下調(diào)。凝集素組化結(jié)果中WGA和ConA表現(xiàn)出相同的結(jié)果。四種識別甘露糖結(jié)構(gòu)的凝集素NPA, HHL, GNA和ConA在J1ESCs和pESCs中展現(xiàn)不同的變化趨勢,NPA和HHL(識別α-1,6甘露糖)的信號值在J1ESCs和pESCs中均下調(diào)；GNA(識別末端α-1,3甘露糖)的信號值在pESCs中下調(diào),在J1ESCs中無顯著變化(p0.05)。對糖基轉(zhuǎn)移酶Alg12和Alg3的實時定量分析結(jié)果顯示,Alg12(α-1,6甘露糖基轉(zhuǎn)移酶)在ESCs和pESCs中均下調(diào),Alg3(α-1,3甘露糖基轉(zhuǎn)移酶)只pESCs中下調(diào),在J1ESCs中無顯著變化,這與凝集素芯片的結(jié)果是一致的。Alg3和Alg12的表達水平影響N-聚糖前體的合成。證明N-聚糖前體的合成在脂肪生成過程中存在下調(diào)。結(jié)論： J1ESCs和pESCs均具有高度全能性,具有向骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞分化的能力,但pESCs的成脂能力較弱。向脂肪誘導(dǎo)分化過程中,J1ESCs和pESCs糖鏈有明顯的變化且十分相似,G1cNAc結(jié)構(gòu)含量上升和α-1,2-巖藻糖基化水平上調(diào),α-1,6巖藻糖基化水平,α-2,6唾液酸化水平和α-1,6甘露糖基化水平下調(diào)。但在該過程中也存在著明顯的不同,α-1,3甘露糖基化水平(GNA和Alg3)只在pESCs下調(diào),在J1ESCs中無顯著變化。
【關(guān)鍵詞】：胚胎干細胞 孤雌胚胎干細胞 脂肪生成 凝集素芯片 糖基化
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329
【目錄】：

• ~.略語表3-5
• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 文獻綜述13-23
• 1 脂肪生成(Adipogenesis)13-15
• 2 胚胎干細胞(ESCs)研究進展15-17
• 2.1 胚胎干細胞15-16
• 2.2 孤雌胚胎干細胞(pESCs)16-17
• 3 糖組學(xué)研究進展17-18
• 4 糖芯片技術(shù)研究進展18-21
• 4.1 凝集素芯片技術(shù)18-21
• 4.2 糖基轉(zhuǎn)移酶芯片技術(shù)21
• 5 本實驗的設(shè)計與意義21-23
• 正文23-62
• 第一部分 胚胎干細胞(ESCs)及孤雌胚胎干細胞(pESCs)的培養(yǎng)及基本特性檢測23-31
• 1 材料23-24
• 1.1 細胞來源及實驗動物23
• 1.2 主要試劑與耗材23
• 1.3 主要儀器23-24
• 1.4 主要試劑配制24
• 2 方法24-26
• 2.1 ESCs和pESCs的培養(yǎng)24-25
• 2.2 擬胚體的制備25
• 2.3 免疫熒光檢測胚胎干細胞全能性25-26
• 2.4 畸胎瘤形成實驗26
• 2.5 細胞增殖能力檢測26
• 3 實驗結(jié)果26-29
• 3.1 ESCs及pESCs的形態(tài)學(xué)觀察及比較26-27
• 3.2 胚胎干細胞及孤雌胚胎干細胞體外檢測27-28
• 3.3 胚胎干細胞及孤雌胚胎干細胞體內(nèi)檢測28
• 3.4 胚胎干細胞及孤雌胚胎干細胞細胞增殖的比較28-29
• 4 討論29-30
• 5 小結(jié)30-31
• 第二部分 胚胎干細胞(ESCs)及孤雌胚胎干細胞(pESCs)的三系分化能力31-40
• 1 材料31-32
• 1.1 細胞來源31
• 1.2 主要試劑31
• 1.3 主要儀器31-32
• 1.4 主要試劑配制32
• 2 方法32-35
• 2.1 胚胎干細胞及擬胚體的培養(yǎng)32
• 2.2 間充質(zhì)樣干細胞的獲得32
• 2.3 成骨誘導(dǎo)32
• 2.4 軟骨誘導(dǎo)32
• 2.5 脂肪誘導(dǎo)32-33
• 2.6 條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下相關(guān)基因表達的檢測33-35
• 2.7 茜素紅染色35
• 2.8 番紅O染色35
• 2.9 油紅O染色35
• 3 實驗結(jié)果35-38
• 3.1 胚胎干細胞三系分化形態(tài)學(xué)的觀察35-37
• 3.2 胚胎干細胞三系分化基因水平檢測37-38
• 4 討論38-39
• 5 小結(jié)39-40
• 第三部分 胚胎干細胞(ESCs)及孤雌胚胎干細胞(pESCs)向脂肪細胞分化的研究40-49
• 1 材料40-41
• 1.1 細胞來源40
• 1.2 主要試劑40
• 1.3 主要儀器40-41
• 2 方法41-42
• 2.1 胚胎干細胞向脂肪細胞的誘導(dǎo)步驟41
• 2.2 實時定量(real time)PCR檢測41-42
• 2.3 油紅O陽性率統(tǒng)計42
• 3 實驗結(jié)果42-46
• 3.1 胚胎干細胞向脂肪細胞分化過程中形態(tài)學(xué)的觀察42-44
• 3.2 胚胎干細胞向脂肪細胞分化過程中蛋白水平的檢測44
• 3.3 胚胎干細胞向脂肪細胞分化過程中基因水平的檢測44-46
• 4 討論46-47
• 5 小結(jié)47-49
• 第四部分 胚胎干細胞(ESCs)及孤雌胚胎干細胞(pESCs)在向脂肪細胞分化過程中蛋白糖基化變化的研究49-62
• 1 材料49-50
• 1.1 細胞來源49
• 1.2 主要試劑49-50
• 1.3 主要儀器50
• 2 方法50-52
• 2.1 胚胎干細胞培養(yǎng)及向脂肪細胞的分化50
• 2.2 總蛋白的提取50
• 2.3 凝集素芯片制備50
• 2.4 蛋白樣本的標記與孵育50-51
• 2.5 凝集素芯片結(jié)果獲取與分析51
• 2.6 凝集素組化51
• 2.7 實時定量pcr檢測糖基轉(zhuǎn)移酶表達水平51-52
• 3 實驗結(jié)果52-56
• 3.1 凝集素芯片實驗結(jié)果52-53
• 3.2 凝集素組化檢測糖鏈在細胞中的分布53-56
• 3.3 糖基轉(zhuǎn)移酶實時定量pcr檢測結(jié)果56
• 4 討論56-57
• 5 小結(jié)57-62
• 全文總結(jié)62-64
• 參考文獻64-72
• 致謝72

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 夏廣軍;金鑫;田萬年;金海國;嚴昌國;;延邊黃牛甲狀腺球蛋白基因的SNPs及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年03期

2 夏廣軍;嚴昌國;金海國;田萬年;金鑫;;延邊黃牛TG基因多態(tài)性與胴體和肉質(zhì)性狀相關(guān)性分析[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2014年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 賈兵兵;環(huán)腺苷酸信號通路調(diào)控人脂肪間充質(zhì)干細胞成脂分化的作用研究[D];浙江大學(xué);2012年

2 張玉超;生長激素與其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT5B對脂肪細胞的影響及其與胰島素信號的Crosstalk[D];山東大學(xué);2013年

3 金蕾;消渴丸對3T3-L1前脂肪細胞增殖及分化的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

4 姜麗麗;臍帶與脂肪來源干細胞生長特性及其心肌分化[D];大連理工大學(xué);2013年

5 伊寶;版納微型豬近交系肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)基因的功能驗證[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 徐揚陽;重組人堿性成纖維細胞生長因子對脂肪干細胞分化的影響[D];鄭州大學(xué);2013年

2 王歡歡;SFRS18對脂肪細胞分化與PPARγ對豬IMF含量影響的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 李一帆;檸檬精油經(jīng)嗅覺通路對DXM肥胖小鼠體重影響研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

4 王文杰;Pygo2通過Wnt信號通路抑制脂肪分化的分子機制[D];廈門大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：胚胎干細胞向脂肪細胞分化過程中蛋白糖基化變化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：329207