本文關(guān)鍵詞：胚胎干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中蛋白糖基化變化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)具有多潛能性及自我更新的能力,對(duì)于研究細(xì)胞分化而言是一類十分有效的材料。與ESCs相似,孤雌胚胎干細(xì)胞(parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs)同樣具有這些特性,ESCs與pESCs均具有向脂肪細(xì)胞分化的潛能,因此研究胚胎干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程的分子機(jī)制對(duì)治療肥胖相關(guān)疾病至關(guān)重要。近年來,胚胎干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的過程已在基因和蛋白水平被廣泛研究,但其過程中蛋白糖基化的變化尚不清楚。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?研究胚胎干細(xì)胞(ESCs)J1和孤雌胚胎干細(xì)胞(pESCs)向脂肪細(xì)胞分化過程中蛋白糖基化的變化情況并比較其差異。方法和結(jié)果： 1.通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白(OCT4,NANOG,SSEA-1)的表達(dá),畸胎瘤形成及細(xì)胞活力(wst-1),比較J1ESCs和pESCs在體內(nèi)、外分化潛能及細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示,J1ESCs和pESCs均保持高度的全能性,細(xì)胞增殖能力無顯著性差異(p0.05)。 2.通過茜素紅、番紅O、油紅O染色及RT-PCR檢測(cè)骨細(xì)胞(ocn和alp)、軟骨細(xì)胞(agg和col Ⅱ)、脂肪細(xì)胞(ppar γ和fabp4)特異性基因的表達(dá),研究J1ESCs和pESCs成骨、成軟骨及成脂能力。結(jié)果顯示,J1ESCs和pESCs均具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能。 3.通過油紅O染色陽性率、免疫熒光檢測(cè)脂肪細(xì)胞特異性蛋白(C/EBP α和FABP4)的表達(dá)、qPCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞特異性基因(ppar γ, fabp4和c/ebp α)及干細(xì)胞特異性基因(oct4)的表達(dá)水平,比較J1ESCs和pESCs向脂肪細(xì)胞分化的能力。結(jié)果顯示,誘導(dǎo)20d后,J1ESCs和pESCs油紅O細(xì)胞陽性率分別為60%±6.4%和42%±6.9%(p0.05),C/EBP α和FABP4蛋白在pESCs誘導(dǎo)5d后均不表達(dá),而在J1ESCs誘導(dǎo)5d后均表達(dá)陽性。ppar γ, fabp4和c/ebp α基因在J1ESCs向脂肪誘導(dǎo)過程中變化倍數(shù)均顯著高于pESCs(p0.05).oct4在ESCs和pESCs中表達(dá)量均顯著下降(p0.05)。 4.通過凝集素芯片技術(shù)及凝集素組化技術(shù)比較J1ESCs和pESCs在脂肪誘導(dǎo)過程中蛋白糖基化的變化。結(jié)果顯示,在37種凝集素中,誘導(dǎo)第20d, J1ESCs和pESCs中有21種凝集素展現(xiàn)出相同的變化,其中7種上升,12種下降,2種無顯著變化。37種凝集素中,兩種胰島素樣活性凝集素在J1ESCs和pESCs中表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。誘導(dǎo)后,WGA(識(shí)別多價(jià)唾液酸和G1cNAc)在J1ESCs和pESCs中均上調(diào),ConA(識(shí)別分支和末端的甘露糖及末端的G1cNAc)的信號(hào)值在J1ESCs中上調(diào),在pESCs中下調(diào)。凝集素組化結(jié)果中WGA和ConA表現(xiàn)出相同的結(jié)果。四種識(shí)別甘露糖結(jié)構(gòu)的凝集素NPA, HHL, GNA和ConA在J1ESCs和pESCs中展現(xiàn)不同的變化趨勢(shì),NPA和HHL(識(shí)別α-1,6甘露糖)的信號(hào)值在J1ESCs和pESCs中均下調(diào)；GNA(識(shí)別末端α-1,3甘露糖)的信號(hào)值在pESCs中下調(diào),在J1ESCs中無顯著變化(p0.05)。對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶Alg12和Alg3的實(shí)時(shí)定量分析結(jié)果顯示,Alg12(α-1,6甘露糖基轉(zhuǎn)移酶)在ESCs和pESCs中均下調(diào),Alg3(α-1,3甘露糖基轉(zhuǎn)移酶)只pESCs中下調(diào),在J1ESCs中無顯著變化,這與凝集素芯片的結(jié)果是一致的。Alg3和Alg12的表達(dá)水平影響N-聚糖前體的合成。證明N-聚糖前體的合成在脂肪生成過程中存在下調(diào)。結(jié)論： J1ESCs和pESCs均具有高度全能性,具有向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化的能力,但pESCs的成脂能力較弱。向脂肪誘導(dǎo)分化過程中,J1ESCs和pESCs糖鏈有明顯的變化且十分相似,G1cNAc結(jié)構(gòu)含量上升和α-1,2-巖藻糖基化水平上調(diào),α-1,6巖藻糖基化水平,α-2,6唾液酸化水平和α-1,6甘露糖基化水平下調(diào)。但在該過程中也存在著明顯的不同,α-1,3甘露糖基化水平(GNA和Alg3)只在pESCs下調(diào),在J1ESCs中無顯著變化。
【關(guān)鍵詞】：胚胎干細(xì)胞 孤雌胚胎干細(xì)胞 脂肪生成 凝集素芯片 糖基化
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329
【目錄】：

• ~.略語表3-5
• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 文獻(xiàn)綜述13-23
• 1 脂肪生成(Adipogenesis)13-15
• 2 胚胎干細(xì)胞(ESCs)研究進(jìn)展15-17
• 2.1 胚胎干細(xì)胞15-16
• 2.2 孤雌胚胎干細(xì)胞(pESCs)16-17
• 3 糖組學(xué)研究進(jìn)展17-18
• 4 糖芯片技術(shù)研究進(jìn)展18-21
• 4.1 凝集素芯片技術(shù)18-21
• 4.2 糖基轉(zhuǎn)移酶芯片技術(shù)21
• 5 本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與意義21-23
• 正文23-62
• 第一部分 胚胎干細(xì)胞(ESCs)及孤雌胚胎干細(xì)胞(pESCs)的培養(yǎng)及基本特性檢測(cè)23-31
• 1 材料23-24
• 1.1 細(xì)胞來源及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 1.2 主要試劑與耗材23
• 1.3 主要儀器23-24
• 1.4 主要試劑配制24
• 2 方法24-26
• 2.1 ESCs和pESCs的培養(yǎng)24-25
• 2.2 擬胚體的制備25
• 2.3 免疫熒光檢測(cè)胚胎干細(xì)胞全能性25-26
• 2.4 畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)26
• 2.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)26
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-29
• 3.1 ESCs及pESCs的形態(tài)學(xué)觀察及比較26-27
• 3.2 胚胎干細(xì)胞及孤雌胚胎干細(xì)胞體外檢測(cè)27-28
• 3.3 胚胎干細(xì)胞及孤雌胚胎干細(xì)胞體內(nèi)檢測(cè)28
• 3.4 胚胎干細(xì)胞及孤雌胚胎干細(xì)胞細(xì)胞增殖的比較28-29
• 4 討論29-30
• 5 小結(jié)30-31
• 第二部分 胚胎干細(xì)胞(ESCs)及孤雌胚胎干細(xì)胞(pESCs)的三系分化能力31-40
• 1 材料31-32
• 1.1 細(xì)胞來源31
• 1.2 主要試劑31
• 1.3 主要儀器31-32
• 1.4 主要試劑配制32
• 2 方法32-35
• 2.1 胚胎干細(xì)胞及擬胚體的培養(yǎng)32
• 2.2 間充質(zhì)樣干細(xì)胞的獲得32
• 2.3 成骨誘導(dǎo)32
• 2.4 軟骨誘導(dǎo)32
• 2.5 脂肪誘導(dǎo)32-33
• 2.6 條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)33-35
• 2.7 茜素紅染色35
• 2.8 番紅O染色35
• 2.9 油紅O染色35
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-38
• 3.1 胚胎干細(xì)胞三系分化形態(tài)學(xué)的觀察35-37
• 3.2 胚胎干細(xì)胞三系分化基因水平檢測(cè)37-38
• 4 討論38-39
• 5 小結(jié)39-40
• 第三部分 胚胎干細(xì)胞(ESCs)及孤雌胚胎干細(xì)胞(pESCs)向脂肪細(xì)胞分化的研究40-49
• 1 材料40-41
• 1.1 細(xì)胞來源40
• 1.2 主要試劑40
• 1.3 主要儀器40-41
• 2 方法41-42
• 2.1 胚胎干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)步驟41
• 2.2 實(shí)時(shí)定量(real time)PCR檢測(cè)41-42
• 2.3 油紅O陽性率統(tǒng)計(jì)42
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-46
• 3.1 胚胎干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中形態(tài)學(xué)的觀察42-44
• 3.2 胚胎干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中蛋白水平的檢測(cè)44
• 3.3 胚胎干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中基因水平的檢測(cè)44-46
• 4 討論46-47
• 5 小結(jié)47-49
• 第四部分 胚胎干細(xì)胞(ESCs)及孤雌胚胎干細(xì)胞(pESCs)在向脂肪細(xì)胞分化過程中蛋白糖基化變化的研究49-62
• 1 材料49-50
• 1.1 細(xì)胞來源49
• 1.2 主要試劑49-50
• 1.3 主要儀器50
• 2 方法50-52
• 2.1 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及向脂肪細(xì)胞的分化50
• 2.2 總蛋白的提取50
• 2.3 凝集素芯片制備50
• 2.4 蛋白樣本的標(biāo)記與孵育50-51
• 2.5 凝集素芯片結(jié)果獲取與分析51
• 2.6 凝集素組化51
• 2.7 實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平51-52
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-56
• 3.1 凝集素芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-53
• 3.2 凝集素組化檢測(cè)糖鏈在細(xì)胞中的分布53-56
• 3.3 糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)結(jié)果56
• 4 討論56-57
• 5 小結(jié)57-62
• 全文總結(jié)62-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 致謝72

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 夏廣軍;金鑫;田萬年;金海國(guó);嚴(yán)昌國(guó);;延邊黃牛甲狀腺球蛋白基因的SNPs及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2014年03期

2 夏廣軍;嚴(yán)昌國(guó);金海國(guó);田萬年;金鑫;;延邊黃牛TG基因多態(tài)性與胴體和肉質(zhì)性狀相關(guān)性分析[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年03期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 賈兵兵;環(huán)腺苷酸信號(hào)通路調(diào)控人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的作用研究[D];浙江大學(xué);2012年

2 張玉超;生長(zhǎng)激素與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子STAT5B對(duì)脂肪細(xì)胞的影響及其與胰島素信號(hào)的Crosstalk[D];山東大學(xué);2013年

3 金蕾;消渴丸對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖及分化的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

4 姜麗麗;臍帶與脂肪來源干細(xì)胞生長(zhǎng)特性及其心肌分化[D];大連理工大學(xué);2013年

5 伊寶;版納微型豬近交系肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)基因的功能驗(yàn)證[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 徐揚(yáng)陽;重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)脂肪干細(xì)胞分化的影響[D];鄭州大學(xué);2013年

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3 李一帆;檸檬精油經(jīng)嗅覺通路對(duì)DXM肥胖小鼠體重影響研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2013年

4 王文杰;Pygo2通過Wnt信號(hào)通路抑制脂肪分化的分子機(jī)制[D];廈門大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：胚胎干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中蛋白糖基化變化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：329207