本文關(guān)鍵詞：高致病性2型豬鏈球菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)分子的篩選與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬鏈球菌(Streptococcus suis, S.suis)為革蘭陽性球菌，根據(jù)其莢膜多糖的差異可以分為35個(gè)血清型，其中2型豬鏈球菌(S.suis2，SS2)致病力最強(qiáng)，分布最為廣泛。SS2是一種重要的人畜共患病原體。它的主要感染宿主是豬，SS2感染現(xiàn)已成為最為重要的豬傳染病之一，每年給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，SS2還能通過傷口和呼吸道等傳播途徑感染人，引起急性腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等。因此，也對(duì)相關(guān)從業(yè)人員的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。既往報(bào)道人感染SS2病例多為散發(fā)，但1998年和2005年我國江蘇和四川先后暴發(fā)兩起大規(guī)模人群SS2感染疫情，部分感染病人短期內(nèi)出現(xiàn)高熱、低血壓休克、多器官功能衰竭等癥狀，病情極為兇險(xiǎn)，病死率極高，為國內(nèi)外首次報(bào)道的由非A群鏈球菌引起的大規(guī)模鏈球菌中毒性休克綜合征(streptococcal toxic shock syndrome, STSS)，給公共衛(wèi)生安全帶來了極大的威脅。 SS2致病機(jī)制較為復(fù)雜，至今尚未完全闡明。陳晨等人通過比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)，引起我國兩次暴發(fā)流行的代表菌株98HAH12和05ZYH33與SS2標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，高致病性SS2含有一個(gè)89K毒力島(pathogenicity island, PAI)，相關(guān)研究結(jié)果高度提示該毒力島與流行菌株的高致病性密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，89K毒力島的5’端含有一段編碼Ⅳ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅳ secretion system，T4SS)的基因簇。T4SS廣泛分布于革蘭陰性細(xì)菌和陽性細(xì)菌，它能夠介導(dǎo)效應(yīng)分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并將其分泌至宿主細(xì)胞或胞外環(huán)境，參與細(xì)菌的致病過程。本課題組前期研究結(jié)果提示，高致病性SS2的T4SS很可能通過分泌某種效應(yīng)分子，參與細(xì)菌的致病過程，引發(fā)STSS。因此，找到T4SS的效應(yīng)分子并對(duì)其功能進(jìn)行深入研究，對(duì)于闡明高致病性SS2引發(fā)STSS的機(jī)制具有重要意義。 為此，本課題首先通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，尋找SS2野生株與T4SS關(guān)鍵組分缺失突變株的差異分泌蛋白，篩選出T4SS的效應(yīng)分子。然后分別在轉(zhuǎn)錄水平、效應(yīng)蛋白分泌水平以及蛋白質(zhì)相互作用水平對(duì)效應(yīng)分子SspA進(jìn)行了驗(yàn)證。最后通過構(gòu)建效應(yīng)分子基因缺失突變株，觀察其對(duì)細(xì)菌毒力以及刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥因子的能力的影響。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.T4SS效應(yīng)分子的篩選：TCA-丙酮沉淀法獲得SS205ZYH33野生株以及T4SS關(guān)鍵組分基因缺失突變株培養(yǎng)上清中的分泌蛋白。通過LC-MS/MS技術(shù)，應(yīng)用質(zhì)譜鳥槍法(shot-gun)策略鑒定上清分泌蛋白，獲得兩株細(xì)菌的分泌蛋白譜，通過分析比較尋找差異蛋白，從而篩選出T4SS相關(guān)的可疑分泌蛋白即候選的效應(yīng)分子。在本實(shí)驗(yàn)中，我們篩選到了7個(gè)候選效應(yīng)分子。7個(gè)候選效應(yīng)蛋白中包括兩個(gè)類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶(SspA)，三個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白，一個(gè)脯氨酰-tRNA合成酶以及一個(gè)假定蛋白。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)際情況我們選擇了其中得分最高的05SSU1982蛋白(SspA)進(jìn)行了深入的研究。 2.效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄水平的驗(yàn)證：提取對(duì)數(shù)后期SS2野生株05ZYH33和T4SS關(guān)鍵組分缺失突變株(virD4、 virB1以及virB4) mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR的方法對(duì)各菌株sspA基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較。結(jié)果表明各菌株sspA基因的轉(zhuǎn)錄無顯著差異，說明在T4SS關(guān)鍵組分缺失的突變株培養(yǎng)上清中檢測不到SspA的分泌并不是由于T4SS組分的缺失影響了sspA基因的轉(zhuǎn)錄。 3.效應(yīng)分子分泌水平的驗(yàn)證：通過大腸桿菌、pET28a表達(dá)系統(tǒng)以及鎳親和層析、離子交換層析的純化方法表達(dá)純化含SspA主要結(jié)構(gòu)域片段的重組蛋白，然后用獲得的純度較高的蛋白免疫小鼠，制備含SspA多克隆抗體的免疫血清，最后通過該免疫血清檢測比較SS2各菌株分泌上清中的效應(yīng)分子SspA，Western blot結(jié)果證實(shí)T4SS介導(dǎo)了效應(yīng)分子SspA的分泌，與質(zhì)譜檢測結(jié)果吻合。 4.T4SS組分VirD4與效應(yīng)分子SspA相互作用的驗(yàn)證：通過pGEX-6p-1載體表達(dá)純化GST-VirD4融合蛋白，并以它作為誘餌，通過Pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它與效應(yīng)分子SspA之間是否存在相互作用。結(jié)果證實(shí)SspA蛋白與T4SS效應(yīng)分子偶聯(lián)蛋白VirD4之間存在直接的相互作用，也是SspA蛋白作為T4SS效應(yīng)分子的有力證據(jù)。 5.T4SS效應(yīng)分子的功能研究：運(yùn)用基因同源重組技術(shù)構(gòu)建sspA基因缺失突變的SS2，，對(duì)效應(yīng)分子SspA的功能進(jìn)行研究。通過BALB/c小鼠感染模型證實(shí)了sspA基因缺失的SS2對(duì)小鼠的致病性減弱，同時(shí)，ELISA炎癥因子檢測實(shí)驗(yàn)表明效應(yīng)分子基因缺失突變株刺激小鼠產(chǎn)生炎癥因子的能力大大降低。 綜上所述，本研究通過蛋白組學(xué)方法篩選出了T4SS的效應(yīng)分子。并分別在轉(zhuǎn)錄水平、效應(yīng)蛋白分泌水平以及蛋白質(zhì)相互作用水平對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)了SspA蛋白確為T4SS的效應(yīng)分子。最后通過構(gòu)建sspA基因缺失突變株以及動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)了sspA基因缺失的SS2對(duì)小鼠的致病性減弱以及刺激小鼠產(chǎn)生炎癥因子的能力大大降低。說明T4SS效應(yīng)分子SspA能夠誘導(dǎo)小鼠炎癥因子分泌，在高致病性SS2引發(fā)的STSS中發(fā)揮了重要作用。
【關(guān)鍵詞】：2型豬鏈球菌 Ⅳ型分泌系統(tǒng) 效應(yīng)分子 鏈球菌中毒性休克綜合征
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• Abstract8-11
• 摘要11-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 T4SS 效應(yīng)分子的篩選18-27
• 2.1 引言18-19
• 2.2 試劑與材料19-21
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-25
• 2.5 討論25-27
• 第三章 T4SS 效應(yīng)分子的驗(yàn)證27-58
• 3.1 效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄水平的驗(yàn)證27-32
• 3.1.1 引言27
• 3.1.2 試劑與材料27-28
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)方法28-30
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-31
• 3.1.5 討論31-32
• 3.2 效應(yīng)分子分泌水平的驗(yàn)證32-49
• 3.2.1 引言32
• 3.2.2 sspA 基因的克隆、表達(dá)及純化32-40
• 3.2.2.1 試劑與材料33-34
• 3.2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 3.2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-40
• 3.2.2.4 討論40
• 3.2.3 SspA 蛋白免疫血清的制備40-45
• 3.2.3.1 試劑與材料40-41
• 3.2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法41-43
• 3.2.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-44
• 3.2.3.4 討論44-45
• 3.2.4 胞外效應(yīng)分子的檢測45-49
• 3.2.4.1 試劑與材料45-46
• 3.2.4.2 實(shí)驗(yàn)方法46-47
• 3.2.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-48
• 3.2.4.4 討論48-49
• 3.3 T4SS 組分 VirD4 與效應(yīng)分子相互作用的驗(yàn)證49-58
• 3.3.1 引言49-50
• 3.3.2 試劑與材料50-51
• 3.3.3 實(shí)驗(yàn)方法51-54
• 3.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-56
• 3.3.5 討論56-58
• 第四章 T4SS 效應(yīng)分子的功能研究58-74
• 4.1 引言58
• 4.2 T4SS 效應(yīng)分子 sspA 基因敲除株的構(gòu)建58-65
• 4.2.1 試劑與材料58-59
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法59-62
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-64
• 4.2.4 討論64-65
• 4.3 sspA 菌株毒力改變分析65-69
• 4.3.1 試劑與材料66
• 4.3.2 實(shí)驗(yàn)方法66-67
• 4.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-68
• 4.3.4 討論68-69
• 4.4 sspA 菌株致炎能力改變分析69-74
• 4.4.1 試劑與材料69-70
• 4.4.2 實(shí)驗(yàn)方法70-71
• 4.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果71-72
• 4.4.4 討論72-74
• 全文總結(jié)74-75
• 參考文獻(xiàn)75-83
• 文獻(xiàn)綜述83-102
• 參考文獻(xiàn)95-102
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章102-103
• 致謝103

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳巍;楊勇軍;;細(xì)菌的Ⅶ型分泌系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年09期

2 張永寧;吳紹強(qiáng);林祥梅;;施馬倫貝格病研究進(jìn)展[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年07期

3 張永寧;吳紹強(qiáng);呂繼洲;馮春燕;王彩霞;鄧俊花;袁向芬;林祥梅;;檢測施馬倫貝格病毒核酸的熒光定量RT-PCR方法[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年11期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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3 張麗R

本文編號(hào)：328285