本文關(guān)鍵詞：骨形成發(fā)生蛋白-2協(xié)同刺激鈦顆粒誘導(dǎo)下的破骨細(xì)胞生成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）在磨粒誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞中的作用。。 方法：1.將小鼠RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于六孔板中，分別加入BMP-2蛋白，鈦顆粒，，BMP-2蛋白和鈦顆粒進(jìn)行培養(yǎng)，利用免疫組化，實(shí)時(shí)定量，免疫印跡等手段對(duì)分化的破骨細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。2.以腺病毒為基礎(chǔ)將TNF-siRNA克隆入pSilencer2.1-hU6載體中，經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆入pGEMT載體，隨后克隆入pAd5E1-MCS-CMVeGFP，形成帶有綠色熒光標(biāo)記的重組腺病毒Ad-TNF-siRNA；將帶有BMP-2的pCDNA3.1載體克隆入pAd5E3-CMV穿梭質(zhì)粒中，然后克隆入pAd5骨架，經(jīng)擴(kuò)增后將帶有TNF-siRNA的腺病毒骨架和帶有BMP-2的骨架經(jīng)PacI酶切線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，最終形成重組腺病毒Ad-BMP-2-TNF-α-siRNA。3.將Ad-TNF-siRNA和Ad-BMP-2-TNF-α-siRNA分別加入含有鈦顆粒的RAW264.7細(xì)胞中，與只加入鈦顆粒的細(xì)胞做對(duì)比，利用免疫組化，免疫印跡，實(shí)時(shí)定量等手段對(duì)分化的破骨細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)BMP-2能夠協(xié)同鈦顆粒刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞的分化。低濃度的BMP-2（30,50ng/ml）在刺激破骨細(xì)胞分化的大小，數(shù)量，細(xì)胞核數(shù)量，破骨細(xì)胞標(biāo)志因子及骨吸收面積上都達(dá)到最佳刺激濃度，本實(shí)驗(yàn)還表明在破骨細(xì)胞分化早期，BMP-2能夠促進(jìn)c-fos與磷酸化的SMAD1/5/8的表達(dá)。BMP-2和鈦顆粒能夠協(xié)同刺激p-JNK,p-P38，p-IkB及p50的表達(dá)。同時(shí)我們利用腺病毒構(gòu)建攜帶TNF-α-siRNA（Ad-TNF-siRNA）和同時(shí)攜帶TNF-α-siRNA與BMP-2（Ad-BMP2-TNFsiRNA）的載體，將其轉(zhuǎn)染加入鈦顆粒的RAW264.7細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)載體都能抑制TNF-α的表達(dá)，但只有Ad-TNF-siRNA能夠顯著抑制小鼠破骨細(xì)胞的分化，而Ad-BMP2-TNFsiRNA能夠增加破骨細(xì)胞分化的大小，數(shù)量，細(xì)胞核數(shù)量，破骨細(xì)胞標(biāo)志因子的表達(dá)及骨吸收面積的大小，并且其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化水平與鈦顆粒誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的水平相似。同時(shí)Ad-BMP2-TNFsiRNA能夠提高早期破骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因c-Fos的表達(dá)，增強(qiáng)p-JNK和p-P38信號(hào)通路的表達(dá)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）在磨粒誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞中的作用。發(fā)現(xiàn)BMP-2能夠協(xié)同鈦顆粒刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞的分化，通過激活p-JNK，p-P38和p-IkB信號(hào)通路，從而顯著提高破骨細(xì)胞分化的大小，數(shù)量，細(xì)胞核的數(shù)量及骨吸收的面積。并且BMP-2提高破骨細(xì)胞的分化能力不受磨粒及其刺激產(chǎn)物TNF-α的影響。本實(shí)驗(yàn)顯示BMP-2在磨粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化中占有關(guān)鍵地位。
【關(guān)鍵詞】：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 鈦顆粒 破骨細(xì)胞 腺病毒 腫瘤壞死因子
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 前言10-18
• 對(duì)象和方法18-31
• 1. 細(xì)胞培養(yǎng)18-19
• 2. 鈦顆粒的處理19
• 3. 細(xì)胞活性檢測(cè)19
• 4. 耐酒石酸鹽酸性磷酸酶（TRAP）檢測(cè)19-20
• 5. 骨吸收水平檢測(cè)20
• 6. ELISA20
• 7. 實(shí)時(shí)定量 PCR20-22
• 8. 免疫印跡（Western blot）22-23
• 9. 腺病毒載體的構(gòu)建23-30
• 10. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法30-31
• 結(jié)果31-41
• 討論41-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 文獻(xiàn)綜述56-67
• 綜述參考文獻(xiàn)64-67
• 致謝67-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文68

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  本文關(guān)鍵詞：骨形成發(fā)生蛋白-2協(xié)同刺激鈦顆粒誘導(dǎo)下的破骨細(xì)胞生成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：328185