本文關鍵詞：新疆出血熱病毒M、S基因DNA疫苗的免疫效果及糖蛋白抗原表位的初步分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：克里米亞剛果出血熱(Crimean—Congo hemorrhagic fever，CCHF)是CCHF病毒引起的一種蜱傳出血熱傳染病，病死率高達50％，分布在世界三十多個國家，已成為危害人類身體健康的重要傳染病之一。在我國于1965年分離得到該病毒，又稱新疆出血熱病毒(Xinjiang hemorrhagic fever，XHFV)，目前已分離到多株病毒,但一直未得到對其切實有效的診斷方法及治療手段。XHFV S基因編碼核蛋白（nucleoprotein，NP）是病毒誘導機體發(fā)生免疫反應的主要抗原，而M基因編碼的糖蛋白（glycoproteins，GP）在CCHFV的感染與致病過程中起著重要作用。因此，研究XHFV核蛋白NP及糖蛋白GP（包括Gn，Gc）片段的抗原性和免疫原性對于加快我國XHFV診斷技術和疫苗的研究具有重要推動作用。本研究構(gòu)建了XHFVS和M基因重組DNA疫苗并檢測了其免疫效果；同時，利用改良生物合成肽法將XHFV79121株糖蛋白Gc片段的截短的16肽基因構(gòu)建到原核表達載體pXXGST-1上進行誘導表達，用制備的抗XHFV糖蛋白兔多抗對多肽進行抗原活性的免疫印跡(Western Blot)分析，確定了Gc上可能存在的抗原表位。本研究主要取得了以下結(jié)果： 1.為篩選XHFV核蛋白（NP）的優(yōu)勢抗原表位，通過誘導表達及純化獲得YL04057株的6種融合蛋白NP（aa1-482）、NP2（aa170-305）、NP2-（caa235-305）、NP2-c-1（aa237-256）、NP2-c-2（aa250-265）、NP2-c-3（aa260-276），分別用重組蛋白對羊血清進行間接ELISA法檢測，以間接免疫熒光法（IFAT）檢測結(jié)果為參照標準進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NP2蛋白的敏感性為73.3%，特異性為100%，總符合率為87.9%，NP2-c蛋白的敏感性為66.7%，特異性為94.4%，總符合率為81.8%。結(jié)果表明NP2和NP2-c的抗原性較強，提示這兩種抗原可以作為研發(fā)新型XHF診斷試劑的候選抗原表位。 2.選取YL04057株核蛋白全長NP（1-482aa）及抗原性較強的基因片段NP2（170-305aa）與糖蛋白（Gn，Gc）基因片段，分別或嵌合構(gòu)建至真核表達載體PVAX1上，獲得5種重組質(zhì)粒：pVAX1-NP，pVAX1-NP2，pVAX1-Gn，pVAX1-Gc及pVAX1-Gc-NP2。以pVAX1為對照組，分別用空載體和重組質(zhì)粒免疫Balb/c小鼠，并用ELISA法、淋巴細胞增殖實驗以及細胞因子水平的檢測基因免疫小鼠后產(chǎn)生的應答效果。結(jié)果顯示，pVAX1-NP2組鼠的血清抗體效價能夠達到1：6400；pVAX1-NP2及pVAX1-Gc-NP2組與對照組相比，小鼠脾臟T淋巴細胞增殖效果明顯（P0.01），這兩個實驗組的IFN-γ表達水平也很高，可以達到865.15pg/mL及1727.205pg/mL，與對照組相比具有極顯著的差異(P0.01)；pVAX1-NP2及pVAX1-Gn組IL-4的表達水平為19.11pg/mL和20.07pg/mL，與對照組的9.35pg/mL相比也有顯著差異(P0.05)。pVAX1-NP2及pVAX1-Gc-NP2實驗組效果最好，提示這兩個重組基因片段可作為XHFV的候選DNA疫苗。 3.對XHFV79121株糖蛋白（Gc）氨基酸序列進行生物信息學分析，以α螺旋，β折疊，轉(zhuǎn)角，疏水性，松散型及B細胞線性抗原表位的預測等多項指標設計10個含有預測抗原表位的16肽，合成后分別構(gòu)建至pXXGST-ST載體上。為制備兔抗多克隆抗血清，將YL04057株編碼糖蛋白M基因C端截短成Gc1及Gc2基因片段，構(gòu)建至pET-28a原核表達載體，并誘導表達純化制備兔抗Gc1及Gc2多克隆抗體。利用多抗通過Western blot法對重組表達的16肽進行抗原性分析，結(jié)果顯示，其中6個16肽能夠與抗血清特異性結(jié)合，表明獲得了6個具有抗原表位的多肽（Gc116-131，Gc228-243，Gc362-377，，Gc370-385，Gc505-520，Gc513-528）。通過保守性分析，發(fā)現(xiàn)首次鑒定出的XHFV糖蛋白的6個抗原表位具有較強的保守性（達到81.25%以上），這為XHFV檢測試劑盒及表位肽疫苗的研制提供了基礎資料。
【關鍵詞】：新疆出血熱病毒 S基因 M基因 基因疫苗 核蛋白 糖蛋白 抗原表位
【學位授予單位】：新疆大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 文獻綜述12-29
• 1 XHF 的檢測、治療和疫苗研究概況12-16
• 1.1 XHF 的檢測12-14
• 1.2 XHF 的治療14-15
• 1.2.1 一般治療措施14
• 1.2.2 利巴韋林14
• 1.2.3 抗體治療14-15
• 1.2.4 其他抗病毒治療15
• 1.3 XHF 的疫苗15-16
• 2 XHF 核蛋白結(jié)構(gòu)及功能特點16-17
• 3 XHF 糖蛋白結(jié)構(gòu)及功能特點17-19
• 4 M 基因進化樹及遺傳特異性19-21
• 5 病毒抗原表位的基本研究方法21-23
• 5.1 抗原表位的分類21
• 5.2 病毒抗原表位的預測方法21-22
• 5.3 抗原肽的合成方法22
• 5.4 病毒抗原表位的篩選、鑒定方法22-23
• 參考文獻23-29
• 第二章 新疆出血熱病毒核蛋白優(yōu)勢表位抗原的篩選29-41
• 摘要29
• 前言29-30
• 1 材料和試劑30-32
• 1.1 材料30-31
• 1.2 試劑31-32
• 1.2.1 主要試劑31
• 1.2.2 主要溶液配方31-32
• 2 研究方法32-34
• 2.1 XHFV NP 蛋白及其截短蛋白的的誘導表達32
• 2.2 原核表達融合蛋白的純化32-34
• 2.2.1 His 標簽蛋白的純化32-33
• 2.2.2 GST 標簽蛋白的純化33
• 2.2.3 PAGE 膠蛋白微量回收33
• 2.2.4 Bradford 法測量蛋白濃度33-34
• 2.3 間接 ELISA 法篩選優(yōu)勢抗原表位34
• 3 結(jié)果與分析34-39
• 3.1 重組蛋白的誘導及純化34-35
• 3.2 間接 ELISA 實驗結(jié)果35-39
• 4 討論39-40
• 參考文獻40-41
• 第三章 重組新疆出血熱病毒 S 和 M 基因疫苗的構(gòu)建及免疫效果41-59
• 摘要41
• 引言41-42
• 1 材料和試劑42-45
• 1.1 材料42-43
• 1.2 試劑43-45
• 1.2.1 主要試劑43
• 1.2.2 培養(yǎng)基和主要溶液配方43-45
• 2 方法45-52
• 2.1 病毒總 RNA 的提取45-46
• 2.2 DNA 疫苗的構(gòu)建與鑒定46-49
• 2.2.1 S, M 基因的克隆與鑒定46-47
• 2.2.2 大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞的制備47
• 2.2.3 重組真核質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選：47-48
• 2.2.4 重組質(zhì)粒的大量提取及純化48-49
• 2.3 小鼠免疫49-50
• 2.4 MTT 法檢測淋巴細胞增殖50
• 2.5 細胞因子 IFN-γ,IL-4 水平的檢測50-51
• 2.6 ELISA 法檢測小鼠血清中抗體效價51
• 2.7 Western Blotting 檢測51-52
• 2.8 統(tǒng)計學分析52
• 3 結(jié)果與分析52-56
• 3.1 重組質(zhì)粒的酶切及 PCR 鑒定52-53
• 3.2 脾 T 淋巴細胞增殖反應分析53-54
• 3.3 細胞因子水平的檢測結(jié)果54-55
• 3.4 小鼠血清的抗體水平檢測結(jié)果55-56
• 3.5 Western blot 分析抗體的特異性56
• 4 討論56-57
• 參考文獻57-59
• 第四章 新疆出血熱病毒 M 基因編碼蛋白分段表達及其抗原性的初步研究59-81
• 摘要59
• 引言59-60
• 1 材料和試劑60-61
• 1.1 材料60-61
• 1.2 主要試劑61
• 2 研究方法61-67
• 2.1 Gc1 和 Gc2 蛋白的表達，純化及多克隆抗體的制備61-63
• 2.1.1 原核表達載體的構(gòu)建61
• 2.1.2 r-Gc1，r-Gc2 融合蛋白的優(yōu)化表達及純化61-62
• 2.1.3 兔抗 rGc1，rGc2 多克隆抗體的制備62
• 2.1.4 多克隆抗體效價的測定62-63
• 2.2 XHFV Gc 蛋白生物信息學分析63
• 2.3 改良生物合成肽策略63-64
• 2.4 XHFV Gc 蛋白 16 肽融合蛋白表達載體的構(gòu)建64-66
• 2.5 XHFV Gc 蛋白 16 肽融合蛋白的表達66-67
• 2.6 Western blot 檢測67
• 3 結(jié)果67-77
• 3.1 Gc 蛋白的生物信息學分析67-68
• 3.2 pET-28a-Gc1 及 pET-28a-Gc2 原核表達載體的構(gòu)建和鑒定68
• 3.3 r-Gc1，r-Gc2 融合蛋白的優(yōu)化表達及純化68-71
• 3.4 抗 rGc1，rGc2 多克隆抗體的滴度測定71-72
• 3.5 Western blot 分析抗體的特異性72-73
• 3.6 16 肽的誘導表達73
• 3.7 Western blot 分析 16 肽的抗原性73-74
• 3.8 16 肽抗原表位的保守性分析74-77
• 4 討論77-79
• 參考文獻79-81
• 附錄81-82
• 個人簡介82-83
• 致謝83

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：新疆出血熱病毒M、S基因DNA疫苗的免疫效果及糖蛋白抗原表位的初步分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：326210