本文關(guān)鍵詞：霍亂毒素A亞單位對DNA疫苗的佐劑效果和機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：佐劑在疫苗的設(shè)計(jì)和和研發(fā)過程中扮演了不可或缺的角色,霍亂毒素是其中一種公認(rèn)的、比較常見的蛋白疫苗佐劑,但到目前為止,其作用機(jī)制仍未被完全闡明。本研究在前期工作基礎(chǔ)上,通過構(gòu)建DNA抗原與霍亂毒素A亞單位(CTA)基因融合表達(dá)質(zhì)粒和將DNA疫苗與CTA質(zhì)�；旌鲜褂脙煞N疫苗形式,觀察CTA對DNA疫苗的佐劑活性,并探討可能的作用機(jī)制。 本研究主要分為對CTA提高疫苗免疫原性的現(xiàn)象描述和它發(fā)揮佐劑作用的機(jī)制解析兩個層次。在對其佐劑效果的闡述中,我們比較了HIV-1AE亞型TRIVN、 TRIVN-CTA融合以及TRIVN+CTA混合三種疫苗形式的抗體與T細(xì)胞免疫原性、T細(xì)胞多功能性、攻擊保護(hù)效果。結(jié)果顯示,TRIVN-CTA (1253±489SFCs/106脾細(xì)胞)和TRIVN+CTA (908±179SFCs/106脾細(xì)胞)可誘導(dǎo)顯著高于TRIVN (642±178SFCs/106脾細(xì)胞)的特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答(p值均小于0.05),且TRIVN-CTA融合疫苗優(yōu)于TRIVN+CTA混合疫苗；TRIVN-CTA也使T細(xì)胞多功能性有了顯著改善,CD8+T細(xì)胞亞群中IFN-γ+TNF-β+IL-2+三陽性細(xì)胞的比例達(dá)到了TRIVN的10倍,TRTVN+CTA的3倍, IFN-y+TNF-a+IL-2-雙陽性細(xì)胞的比例達(dá)到了TRIVN的6倍；針對A、B、C三個亞型Ne蹯白的結(jié)合抗體滴度檢測結(jié)果顯示TRIVN-CTA可以刺激出較高的體液免疫反應(yīng),結(jié)合抗體滴度要高于TRTVN和TRIVN+CTA組；對疫苗攻擊保護(hù)效果的評價上,雖然我們的TRIVN疫苗的保護(hù)效果非常好,但是TRIVN-CTA和TRIVN+CTA幾乎達(dá)到了100%的保護(hù),小鼠體內(nèi)沒有檢測到痘病毒。綜上所述,與TRIVN疫苗相比,CTA佐劑的加入提高了疫苗的免疫原性,比單獨(dú)的抗原更具有優(yōu)勢；而且TRIVN-CTA融合疫苗要比TRIVN+CTA混合疫苗有著更顯著的優(yōu)勢,同時也提示我們不同的使用方式下佐劑對疫苗量與質(zhì)的改善程度是有區(qū)別的。 我們在上述工作基礎(chǔ)上又進(jìn)一步探討了其發(fā)揮佐劑作用的內(nèi)在分子生物學(xué)機(jī)制。分別應(yīng)用體外細(xì)胞模型和和體內(nèi)小鼠模型進(jìn)行了相關(guān)研究,體外NIH3T3細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞上我們分別觀察到TRIVN-CTA和CTA可顯著提高IL-6和IL-1β細(xì)胞因子的分泌；體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TRIVN-CTA和CTA免疫后免疫局部肌肉組織中的IL-6和IL-1p這兩種細(xì)胞因子的表達(dá)與TRTVN相比都有顯著升高。以上結(jié)果說明,CTA在以DNA形式作為DNA疫苗佐劑時,通過系統(tǒng)免疫的方式可以提高IL-6和IL-1β的水平,這可能是CTA提高免疫原性的內(nèi)在機(jī)制。 隨后,通過進(jìn)一步對CTA下游信號通路的相關(guān)研究,我們發(fā)現(xiàn)IL-6和IL-1β這兩種細(xì)胞因子分泌的提高與CTA的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性密切相關(guān)(即產(chǎn)生cAMP的能力)。因?yàn)樵贜IH3T3細(xì)胞上,Forskolin (cAMP激活劑)可刺激IL-6的分泌,而H89(PKA抑制劑)則抑制IL-6的分泌；在RAW細(xì)胞上,Forskolin (cAMP激活劑)可刺激IL-1β的分泌,而H89(PKA抑制劑)則抑制IL-1β的分泌。接下來我們又探討了CTA的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性與免疫原性之間的關(guān)系,使用對CTA的ADP-核糖基位點(diǎn)進(jìn)行突變構(gòu)建的OVA-mCTA疫苗,與未突變的OVA-CTA疫苗免疫小鼠后我們發(fā)現(xiàn)OVA-mCTA (48±44SFCs/106脾細(xì)胞)的免疫原性弱于OVA-CTA (98±37SFCs/106脾細(xì)胞),這說明CTA對免疫原性的提高是通過cAMP發(fā)揮作用的。 通過以上兩個層次的研究,我們認(rèn)為AE-TRIVN-CTA融合疫苗相較于簡單的混合疫苗更有助于改善DNA疫苗的免疫原性、T細(xì)胞多功能性、體液免疫反應(yīng)、攻擊保護(hù)效果等諸多指標(biāo),且CTA的佐劑作用極有可能是通過cAMP介導(dǎo)的IL-6和IL-1β這兩種前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生并改善了免疫局部的微環(huán)境所致。這就揭示了CTA基因在動物體內(nèi)作為HIV DNA疫苗佐劑上有十分重要的應(yīng)用價值,更重要的是提示CTA佐劑在以不同免疫方式不同作用形式作為佐劑時的作用機(jī)制是不盡相同。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 DNA疫苗 CTA 佐劑 IL-6 IL-1β cAMP
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 主要英文縮略詞4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-11
• 一 實(shí)驗(yàn)材料11-14
• 二 實(shí)驗(yàn)方法14-23
• 三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-45
• 四 討論45-47
• 結(jié)論47
• 論文創(chuàng)新性47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 附錄52-53
• 致謝53-54
• 綜述：疫苗佐劑研究進(jìn)展54-62
• 參考文獻(xiàn)59-62

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：326174