本文關(guān)鍵詞：裂頭蚴河南不同地理株的蟲種鑒定、遺傳變異及抗原多肽基因的表達(dá)及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：裂頭蚴病(sparganosis)主要是由曼氏迭宮絳蟲(Spirometra mansoni)幼蟲-裂頭蚴(sparganum)感染而引起的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病,該病呈世界性分布。裂頭蚴感染人體后,可在各種組織器官內(nèi)移行引起炎癥反應(yīng),導(dǎo)致皮下包塊、失明、肢體麻痹、癲癇、甚至死亡。傳統(tǒng)的迭宮屬絳蟲的鑒別主要是通過形態(tài)學(xué)鑒定,而迭宮屬絳蟲的幼蟲階段缺乏形態(tài)學(xué)特征難以鑒別,因此,應(yīng)用分子生物學(xué)方法對迭宮屬絳蟲幼蟲進(jìn)行蟲種鑒定及遺傳變異分析,對裂頭蚴病的防治具有重要意義。此外,裂頭蚴含有重復(fù)序列的抗原多肽(antigenic polypeptide, SAP, GenBank No. AB019222.1)可能是裂頭蚴的保護(hù)性抗原,對裂頭蚴的免疫逃避及其在宿主體內(nèi)的長期寄生可能起著重要作用。 為了鑒定裂頭蚴河南不同地理株的蟲種、研究其遺傳變異與系統(tǒng)發(fā)育地位,本文從河南省6個地區(qū)(開封、鄭州、扶溝、新鄉(xiāng)、漯河、周口)自然感染的青蛙體內(nèi)分離裂頭蚴,經(jīng)口感染家貓后收集蟲卵與成蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,選取曼氏迭宮絳蟲3個線粒體基因(cox1、cox3和nad4)作為分子標(biāo)記,對河南6個地區(qū)的裂頭蚴進(jìn)行了序列分析及遺傳變異分析。此外,本文還應(yīng)用基因工程技術(shù)對裂頭蚴抗原多肽基因進(jìn)行了克隆與表達(dá),將純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠獲得重組蛋白免疫血清,應(yīng)用Western blotting及間接免疫熒光試驗(IFA)發(fā)現(xiàn)裂頭蚴抗原多肽在曼氏迭宮絳蟲不同發(fā)育期的表達(dá)及其在蟲體組織的定位,并將其用于裂頭蚴感染小鼠血清的特異性抗體的檢測,對裂頭蚴病的檢測提供新的候選抗原。 材料與方法 1.裂頭蚴的采集與實驗動物感染：從河南省漯河、開封、鄭州、新鄉(xiāng)、通許、扶溝六地區(qū)自然感染青蛙體內(nèi)分離裂頭蚴。將六地區(qū)分離出的裂頭蚴經(jīng)口感染6只3月齡的無病原體家貓(10條／只),在感染后8-25天當(dāng)中,每天使用自然沉淀法收集貓糞便中的蟲卵在顯微鏡下進(jìn)行鑒定,感染后4周將貓剖殺,從貓小腸內(nèi)收集成蟲并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。 2.幼蟲和成蟲目的基因的擴(kuò)增及序列分析：對曼氏迭宮絳蟲cox1、cox3和nad4三個線粒體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將純化后的PCR產(chǎn)物送北京金唯智生物公司進(jìn)行雙向測序。首先使用Clustal X v2.0中的默認(rèn)參數(shù)設(shè)置對3個基因序列進(jìn)行比對然后在Se-Al v2.0a11中對比對序列進(jìn)行校正。使用MEGA v5.0軟件進(jìn)行遺傳距離分析。 3.系統(tǒng)發(fā)育分析：最后分別利用PAUP*4b10、PhyMLv3.0和MrBayes v3.1軟件對cox1+cox3+pnad4三基因聯(lián)合序列進(jìn)行最大簡約法(MP)、最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)分析,并繪制曼氏迭宮絳蟲河南省6個地區(qū)分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹。 4.裂頭蚴抗原多肽基因的克隆與表達(dá)：合成裂頭蚴抗原多肽基因,并在序列兩端添加酶切位點5’BamHI和3'HindⅢ保證在裂頭蚴抗原多肽基因序列中僅有BamHI和HindⅢ2個酶切位點。將多肽基因克隆至載體pUC57-Kan。將目的基因雙酶切后亞克隆至表達(dá)載體pMAL-c2X,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Escherichia coli)BL21,對重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP進(jìn)行酶切鑒定,結(jié)果正確后用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體沉淀經(jīng)超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE,觀察是否有抗原多肽蛋白的表達(dá),并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行可溶性分析。 5.裂頭蚴抗原多肽重組蛋白的鑒定：應(yīng)用Amylose樹脂預(yù)裝柱對表達(dá)的裂頭蚴抗原多肽重組蛋白進(jìn)行親和層析純化,將純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠,獲得重組蛋白免疫血清,通過Western blotting應(yīng)用重組蛋白免疫血清對重組蛋白、裂頭蚴可溶性抗原及ES抗原進(jìn)行識別。 將從自然感染蛙體與實驗感染鼠體內(nèi)分離的裂頭蚴以及貓體內(nèi)收集的成蟲進(jìn)行石臘切片,應(yīng)用IFA檢測裂頭蚴抗原多肽在曼氏迭宮絳蟲不同發(fā)育期蟲體的表達(dá)及其在蟲體組織的定位。應(yīng)用重組蛋白與裂頭蚴ES蛋白分別用于檢測裂頭蚴感染小鼠及其他寄生蟲感染小鼠血清,觀察SAP-ELISA診斷裂頭蚴病的敏感性與特異性。 結(jié)果 1.蟲卵與成蟲的形態(tài)學(xué)鑒定：裂頭蚴經(jīng)口感染貓后11天,在貓糞便中發(fā)現(xiàn)蟲卵；感染后4周從每只貓的小腸內(nèi)檢出10條26～45厘米長的成蟲。蟲卵卵殼較薄、淺灰褐色、呈橢圓形,52～76微米長、31～44微米寬,且兩端稍尖、一端有卵蓋,內(nèi)有一個卵細(xì)胞和若干個卵黃細(xì)胞�；谌缦滦螒B(tài)特征將收集的成蟲鑒定為曼氏迭宮絳蟲：頭節(jié)背、腹面各有一條縱行的吸槽,成節(jié)和孕節(jié)結(jié)構(gòu)基本相似,肉眼可見每個節(jié)片中部凸起的子宮。并且在節(jié)片中部依次有雄性生殖孔、雌性生殖孔和子宮孔三個開口。 2.裂頭蚴河南不同地理株的遺傳變異分析：鄭州、開封、通許、扶溝、新鄉(xiāng)、漯河6地區(qū)收集的裂頭蚴及其成蟲的cox1,cox3和nad4基因片段,均被成功擴(kuò)增,其序列長度分別為417、390和578bp,且成蟲與幼蟲序列大小完全一致。cox1,cox3和nad4基因片段均富含AT堿基(AT含量分別為63.5%,68.3%和67%),其序列變化范圍分別為0-4.4%、0-0.8%和0-0.5%。 3.裂頭蚴河南不同地理株的系統(tǒng)發(fā)育分析：cox,cox3和nad4序列的最適進(jìn)化模型分別為TN93+I、HKY+G和HKY+I。對coxl+cox3+pnad4聯(lián)合序列分別采用最大簡約法、最大似然法和貝葉斯法的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,河南6個地區(qū)的裂頭蚴分離株與其他迭宮屬(Spirometra)絳蟲一起形成一個具有高支持值的單系分支(其自展值和后驗概率值分別為100、99和1.0),并與裂頭屬(Diphyllobothrium)絳蟲分支互為姊妹類群。 4.裂頭蚴抗原多肽基因的克隆與表達(dá)：對重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP進(jìn)行酶切鑒定,電泳后出現(xiàn)2條帶,1條帶為線性的pMAL-c2X(大小為6646bp)；另1條為783bp,與裂頭蚴抗原多肽的理論值大小相同,表明重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP構(gòu)建成功。對重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在68.7kDa處出現(xiàn)一條明顯的蛋白帶(載體融合蛋白40kDa+目的蛋白28.7kDa),表明重組蛋白表達(dá)成功,可溶性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白以可溶形式表達(dá)。 5.裂頭蚴抗原多肽重組蛋白的鑒定：Western blotting結(jié)果顯示,裂頭蚴抗原多肽重組蛋白可被裂頭蚴感染小鼠血清所識別；重組蛋白免疫血清可識別裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原,在28.7kDa處有1條蛋白帶,表明裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原均存在。IFA結(jié)果顯示,重組蛋白免疫血清與蛙體與鼠體內(nèi)的裂頭蚴均呈現(xiàn)陽性反應(yīng),蟲體皮層及內(nèi)部組織均呈黃綠色熒光,但與成蟲則為陰性反應(yīng),蟲體呈橘紅色,表明裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴期表達(dá),在成蟲期則不表達(dá)。SAP-ELISA和ES-ELISA檢測裂頭蚴感染小鼠血清抗體陽性率分別為83.8%(25/30)和100%(30/30),SAP-ELISA的陽性率低于ES-ELISA(P0.05).檢測弓形蟲、血吸蟲、旋毛蟲感染小鼠血清和正常小鼠血清均為陰性。 結(jié)論 1.經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定,河南6個地區(qū)的裂頭蚴分離株均屬于曼氏迭宮絳蟲,cox1,cox3和nad4基因均能很好地揭示裂頭蚴各地理株線粒體之間的遺傳變異,且coxl的變異程度最高,cox3次之而nad4的變異程度最低。 2.成功構(gòu)建了裂頭蚴抗原多肽的表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP,重組蛋白以可溶形式表達(dá)。Western blotting與IFA結(jié)果表明,裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴期表達(dá),在裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原均存在,定位于蟲體皮層及內(nèi)部組織；在成蟲期則不表達(dá)。 3. SAP-ELISA檢測裂頭蚴感染小鼠血清抗體具有良好的敏感性與特異性,提示此重組蛋白可作為檢測裂頭蚴病的候選抗原。
【關(guān)鍵詞】：裂頭蚴 曼氏迭宮絳蟲 遺傳變異 線粒體基因 抗原多肽 表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R383
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-15
• 英文縮略詞表15-16
• 1 前言16-18
• 1.1 裂頭蚴及裂頭蚴病16
• 1.2 裂頭蚴病的流行情況16-17
• 1.3 曼氏迭宮絳蟲的系統(tǒng)發(fā)育研究17
• 1.4 目的與意義17-18
• 2 材料與方法18-34
• 2.1 試劑18
• 2.2 儀器18-19
• 2.3 溶液的配置19-21
• 2.3.1 DNA提取所需試劑19
• 2.3.2 LB培養(yǎng)基的配置19
• 2.3.3 質(zhì)粒提取所需試劑19
• 2.3.4 ELISA所需試劑19-20
• 2.3.5 凝膠配制所需試劑20-21
• 2.3.6 Western blot所需試劑21
• 2.4 實驗動物21-22
• 2.5 曼氏裂頭蚴的采集與分離22
• 2.6 曼氏迭宮絳蟲成蟲的獲取22-32
• 2.6.1 實驗動物感染22
• 2.6.2 成蟲的收集22
• 2.6.3 節(jié)片的固定及保存22
• 2.6.4 頭節(jié)的固定及保存22-23
• 2.6.5 孕節(jié)標(biāo)本的制作23
• 2.6.6 基因組DNA的提取23
• 2.6.7 PCR擴(kuò)增23-24
• 2.6.8 序列分析24
• 2.6.9 系統(tǒng)發(fā)育分析24-25
• 2.6.10 裂頭蚴抗原多肽基因的合成25
• 2.6.11 質(zhì)粒的提取25
• 2.6.12 質(zhì)粒及目的基因的雙酶切及膠回收25-26
• 2.6.13 目的基因與質(zhì)粒的連接反應(yīng)26-27
• 2.6.14 BL21感受態(tài)細(xì)菌制備27
• 2.6.15 轉(zhuǎn)化及驗證27
• 2.6.16 誘導(dǎo)表達(dá)27-28
• 2.6.17 SDS-PAGE電泳28
• 2.6.18 重組蛋白的可溶性鑒定28-29
• 2.6.19 重組蛋白的純化29-30
• 2.6.20 純化后蛋白的濃度測定30
• 2.6.21 Western-blot鑒定30
• 2.6.22 動物實驗30-32
• 2.7 裂頭蚴抗原多肽的定位32-34
• 2.7.1 組織標(biāo)本石蠟切片制作32-33
• 2.7.2 間接免疫熒光33
• 2.7.3 ELISA法檢測裂頭蚴及其他寄生蟲感染小鼠血清33-34
• 3 結(jié)果34-50
• 3.1 曼氏裂頭蚴的采集34
• 3.2 曼氏迭宮絳蟲成蟲34-35
• 3.3 目的基因的擴(kuò)增35-37
• 3.4 序列分析37
• 3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析37-38
• 3.6 裂頭蚴抗原多肽基因的生物信息學(xué)分析38-41
• 3.7 抗原多肽基因的合成41-42
• 3.8 質(zhì)粒的雙酶切和目的基因的膠回收42-43
• 3.9 目的基因和質(zhì)粒的連接及鑒定43-44
• 3.10 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)44-45
• 3.11 重組蛋白的可溶性分析45-46
• 3.12 重組蛋白的純化及濃度測定46
• 3.13 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線及裂頭蚴重組蛋白的濃度46-47
• 3.14 重組蛋白的Western-blot分析47-48
• 3.15 ELISA檢測免疫血清抗體效價48
• 3.16 裂頭蚴抗原多肽在蟲體組織定位48-49
• 3.17 ELISA檢測裂頭蚴感染小鼠血清49-50
• 4 討論50-52
• 4.1 曼氏裂頭蚴的遺傳變異及系統(tǒng)發(fā)育分析50-51
• 4.2 裂頭蚴抗原多肽的克隆表達(dá)分析51-52
• 5 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 綜述 曼氏裂頭蚴病的流行及研究現(xiàn)狀57-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 碩士在讀期間發(fā)表的論文目錄68-69
• 致謝69

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：325896