發(fā)布時(shí)間：2017-04-24 02:06

  本文關(guān)鍵詞：重組人IL-4、IL-13的克隆、表達(dá)和鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：白細(xì)胞介素（interleukin，IL）是非常重要的細(xì)胞因子家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、免疫細(xì)胞的活化與分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)炎癥發(fā)生過(guò)程中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的成員已達(dá)35個(gè)，被命名為IL-1～I(xiàn)L-35。IL-4和IL-13主要由活化的CD4+Th2細(xì)胞產(chǎn)生，活化的肥大細(xì)胞等也可產(chǎn)生。IL-4和IL-13共享信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，二者都可與靶細(xì)胞上由IL4Rα鏈和IL13Rα1鏈組成的受體復(fù)合物結(jié)合，從而將信號(hào)傳導(dǎo)到胞漿，故二者部分功能重疊。IL-4和IL-13可通過(guò)激活嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞促進(jìn)氣道炎癥，增強(qiáng)纖維母細(xì)胞的增殖與活化引起氣道重塑；激活B細(xì)胞產(chǎn)生IgE；刺激氣道上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞產(chǎn)生黏液；激活氣道平滑肌細(xì)胞引起氣道高反應(yīng)性，在過(guò)敏性炎癥疾病中起著重要的作用。基于IL-4/IL-13信號(hào)途徑在過(guò)敏性炎癥疾病中發(fā)揮重要的作用，可通過(guò)阻斷Il-4/IL-13信號(hào)傳導(dǎo)干預(yù)治療過(guò)敏性炎癥疾病，但以往研究表明，抗IL-4和抗IL-13的單克隆抗體用于治療過(guò)敏性炎癥疾病，未取得滿意效果。因此，制備中和性抗IL-4和IL-13雙特異性抗體，以封阻它們的生物學(xué)活性，對(duì)于過(guò)敏性炎癥疾病的治療具有很大的潛力。本研究克隆、表達(dá)及鑒定了人IL-4和IL-13重組蛋白，為后期雙特異性抗體的制備奠定基礎(chǔ)。方法：1.從健康志愿者外周血中分離PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血單個(gè)核細(xì)胞），提取總RNA，從NCBI（National Center ofBiotechnology Information，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心）下載人IL-4和IL-13mRNA序列，設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR擴(kuò)增IL-4和IL-13cDNA。2.將PCR產(chǎn)物與pET101/D-TOPO載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli TOPO10，菌落PCR驗(yàn)證基因插入是否正確，提取重組質(zhì)粒送上海生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。3.將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，小量表達(dá)，SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析篩選高表達(dá)量克隆子。4.篩選到的高表達(dá)量克隆子用1mmol/L IPTG （isopro pyl-β-d-thiogalactoside，異丙基-β-d-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)表達(dá)，按Invitrogen公司的Ni-NTA純化試劑盒的變性條件純化蛋白。5. Western blot鑒定表達(dá)的融合蛋白。結(jié)果：1. PCR最終擴(kuò)增得到IL-4開(kāi)放閱讀框基因，其大小為460bp左右；擴(kuò)增得到IL-13開(kāi)放閱讀框基因，，其大小為430bp左右，測(cè)序驗(yàn)證序列正確。2. IL-4/pET101和IL-13/pET101重組質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證序列正確。3.誘導(dǎo)表達(dá)后的IL-4融合蛋白條帶大小為28kDa左右，與目的蛋白大小一致。相同條件下4個(gè)克隆子中IL4-1表達(dá)量最高，其次是IL4-2和IL4-4，IL4-3基本無(wú)表達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)后的IL-13融合蛋白條帶大小為26kDa左右，與目的蛋白大小一致。4.將大量表達(dá)的IL4-1和IL-13應(yīng)用Ni-NTA親和純化柱在變性條件下進(jìn)行了純化。結(jié)果表明：純化的IL-4蛋白在28kDa處出現(xiàn)了單一條帶，與目的蛋白大小一致；純化的IL-13在26kDa處出現(xiàn)了單一條帶，與目的蛋白大小一致。5.將表達(dá)的IL4-1蛋白和IL-13蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示，表達(dá)的蛋白即為目的蛋白IL-4和IL-13。結(jié)論：1.成功擴(kuò)增到IL-4的開(kāi)放閱讀框基因，其大小為460bp；成功擴(kuò)增到IL-13的開(kāi)放閱讀框基因，其大小為430bp。2.成功構(gòu)建了人IL-4/pET101和IL-13/pET101重組表達(dá)載體。3.成功表達(dá)并純化了人IL-4和IL-13融合蛋白。
【關(guān)鍵詞】：人IL-4 人IL-13 表達(dá) 鑒定
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 目錄3-4
• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 前言10-14
• 材料與方法14-24
• 結(jié)果24-32
• 討論32-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-42
• 英漢縮略詞對(duì)照表42-43
• 致謝43-44
• 綜述44-55
• 參考文獻(xiàn)51-55

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