本文關(guān)鍵詞：重組人IL-4、IL-13的克隆、表達和鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：白細胞介素（interleukin，IL）是非常重要的細胞因子家族，在調(diào)節(jié)細胞生長分化、免疫細胞的活化與分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)炎癥發(fā)生過程中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的成員已達35個，被命名為IL-1～IL-35。IL-4和IL-13主要由活化的CD4+Th2細胞產(chǎn)生，活化的肥大細胞等也可產(chǎn)生。IL-4和IL-13共享信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，二者都可與靶細胞上由IL4Rα鏈和IL13Rα1鏈組成的受體復(fù)合物結(jié)合，從而將信號傳導(dǎo)到胞漿，故二者部分功能重疊。IL-4和IL-13可通過激活嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞促進氣道炎癥，增強纖維母細胞的增殖與活化引起氣道重塑；激活B細胞產(chǎn)生IgE；刺激氣道上皮細胞、杯狀細胞產(chǎn)生黏液；激活氣道平滑肌細胞引起氣道高反應(yīng)性，在過敏性炎癥疾病中起著重要的作用�；贗L-4/IL-13信號途徑在過敏性炎癥疾病中發(fā)揮重要的作用，可通過阻斷Il-4/IL-13信號傳導(dǎo)干預(yù)治療過敏性炎癥疾病，但以往研究表明，抗IL-4和抗IL-13的單克隆抗體用于治療過敏性炎癥疾病，未取得滿意效果。因此，制備中和性抗IL-4和IL-13雙特異性抗體，以封阻它們的生物學活性，對于過敏性炎癥疾病的治療具有很大的潛力。本研究克隆、表達及鑒定了人IL-4和IL-13重組蛋白，為后期雙特異性抗體的制備奠定基礎(chǔ)。方法：1.從健康志愿者外周血中分離PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血單個核細胞），提取總RNA，從NCBI（National Center ofBiotechnology Information，美國國家生物技術(shù)信息中心）下載人IL-4和IL-13mRNA序列，設(shè)計引物，采用RT-PCR擴增IL-4和IL-13cDNA。2.將PCR產(chǎn)物與pET101/D-TOPO載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli TOPO10，菌落PCR驗證基因插入是否正確，提取重組質(zhì)粒送上海生物技術(shù)有限公司進行測序驗證。3.將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，小量表達，SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析篩選高表達量克隆子。4.篩選到的高表達量克隆子用1mmol/L IPTG （isopro pyl-β-d-thiogalactoside，異丙基-β-d-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)表達，按Invitrogen公司的Ni-NTA純化試劑盒的變性條件純化蛋白。5. Western blot鑒定表達的融合蛋白。結(jié)果：1. PCR最終擴增得到IL-4開放閱讀框基因，其大小為460bp左右；擴增得到IL-13開放閱讀框基因，，其大小為430bp左右，測序驗證序列正確。2. IL-4/pET101和IL-13/pET101重組質(zhì)粒測序驗證序列正確。3.誘導(dǎo)表達后的IL-4融合蛋白條帶大小為28kDa左右，與目的蛋白大小一致。相同條件下4個克隆子中IL4-1表達量最高，其次是IL4-2和IL4-4，IL4-3基本無表達；誘導(dǎo)表達后的IL-13融合蛋白條帶大小為26kDa左右，與目的蛋白大小一致。4.將大量表達的IL4-1和IL-13應(yīng)用Ni-NTA親和純化柱在變性條件下進行了純化。結(jié)果表明：純化的IL-4蛋白在28kDa處出現(xiàn)了單一條帶，與目的蛋白大小一致；純化的IL-13在26kDa處出現(xiàn)了單一條帶，與目的蛋白大小一致。5.將表達的IL4-1蛋白和IL-13蛋白進行Western blot驗證，結(jié)果顯示，表達的蛋白即為目的蛋白IL-4和IL-13。結(jié)論：1.成功擴增到IL-4的開放閱讀框基因，其大小為460bp；成功擴增到IL-13的開放閱讀框基因，其大小為430bp。2.成功構(gòu)建了人IL-4/pET101和IL-13/pET101重組表達載體。3.成功表達并純化了人IL-4和IL-13融合蛋白。
【關(guān)鍵詞】：人IL-4 人IL-13 表達 鑒定
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 目錄3-4
• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 前言10-14
• 材料與方法14-24
• 結(jié)果24-32
• 討論32-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻38-42
• 英漢縮略詞對照表42-43
• 致謝43-44
• 綜述44-55
• 參考文獻51-55

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本文編號：323382