本文關(guān)鍵詞：腎小管上皮細(xì)胞中HIF-1α對(duì)MICA調(diào)控作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的 人類主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ相關(guān)基因A (MICA)在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。越來越多的臨床研究表明,腎移植受者血清中抗MICA抗體的含量與移植后急性和慢性排斥反應(yīng)發(fā)生率密切相關(guān),但目前其激活和作用機(jī)制仍不清楚。有研究發(fā)現(xiàn),缺血再灌注(I/R)損傷可以上調(diào)小鼠腎臟中MICA表達(dá),而低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)表達(dá)增加作為缺血早期首發(fā)的分子水平適應(yīng)性反應(yīng),能通過調(diào)控下游系列基因表達(dá),介導(dǎo)與缺氧相關(guān)的各種生理性反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)人原代心肌細(xì)胞中,HIF-la過表達(dá)能上調(diào)MICA表達(dá)。因此推測(cè)人腎小管上皮細(xì)胞也可能存在類似激活作用機(jī)制。因此,本研究的目的在于初步探討人腎小管上皮細(xì)胞中HIF-la過表達(dá)是否可增強(qiáng)細(xì)胞MICA基因表達(dá)。 方法 1.進(jìn)行腎小管上皮細(xì)胞系培養(yǎng),摸索建立體外缺血再灌注模型,確定在2%氧濃度下缺氧18h后正常供氧。 2.進(jìn)行重組腺病毒的擴(kuò)增、純化,采用組織培養(yǎng)感染劑量法(tissue culture infections dose, TCID法)進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。 3.轉(zhuǎn)染在常氧下可以穩(wěn)定表達(dá)并發(fā)揮正常功能的HIF-1α重組腺病毒(Ad.CMV.HIF-1α△ODD),在轉(zhuǎn)染的24、28、72、96h后用TRIZOL提取HK-2的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法,以B-ACTIN作為內(nèi)參因,通過熒光定量PCR檢測(cè)HIF-la、 HO-1、 VEGF和MICA的基因轉(zhuǎn)錄水平。在腺病毒轉(zhuǎn)染的96h用免疫熒光的方法檢測(cè)目的基因HIF-1a在HK-2中蛋白水平的表達(dá)情況。 4.體外用缺氧再給氧(H/R)模型模擬I/R,HIF-la基因沉默后,將經(jīng)過RNAi處理過的細(xì)胞在2%氧濃度下培養(yǎng)18h進(jìn)行缺氧后,在缺氧再給氧的Oh、4h、8h和16h收集細(xì)胞。用TRIZOI法提取HK-2細(xì)胞的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。同時(shí)以基因β-ACTIN作為內(nèi)參,通過熒光定量的方法檢測(cè)HIF-1a和MICA基因的轉(zhuǎn)錄水平。 5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)來表示。兩組均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn),使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算,P0.05認(rèn)為有顯著性差異。 結(jié)果 1.在常氧條件下,HIF-1a的過表達(dá)可以上調(diào)細(xì)胞MICA基因蛋白的表達(dá)。Ad.CMV.HIF-1a△ODD組和Ad.CMV.HIF-la組的HIF-lamRNA水平從轉(zhuǎn)染的24h后就開始升高,在72h達(dá)到高峰,96h有略微的下降；并且兩組間mRNA水平差異不大,在HIF-la基因的轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)相似。而Ad.CMV.LacZ組和非轉(zhuǎn)基因組的HIF-la mRNA水平相比前兩組一直保持很低水平,并且基本無變化。免疫熒光結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染的96h后,Ad.CMV.HIF-la△ODD組的HIF-1a蛋白的表達(dá)較正常組顯著增加,而Ad.CMV.HIF-1a組中僅檢測(cè)到少量HIF-1a的表達(dá)；而Ad.CMV.LacZ組和非轉(zhuǎn)基因組中均未檢測(cè)到HIF-la蛋白的表達(dá),提示在常氧狀態(tài)下,改造后的HIF-la△ODD較HIF-la的蛋白表達(dá)更為穩(wěn)定,不受氧依賴性的降解。 2.常氧狀態(tài)下,Ad.CMV. LacZ組合和非轉(zhuǎn)基因的MICA mRNA水平一直基本無變化,提示一般的腺病毒感染不會(huì)啟動(dòng)MICA基因的轉(zhuǎn)錄,而Ad.CMV.HIF-la△ODD組的MICA mRNA水平在轉(zhuǎn)染后的48h較前兩組有明顯的升高,并在96h達(dá)到對(duì)照組的三倍。Ad.CMV.HIF-1a組的MICA mRNA水平在轉(zhuǎn)染后的72h較對(duì)照組有明顯升高,大約是對(duì)照組的兩倍,但一直明顯低于Ad.CMV.HIF-1a△ODD組。提示常氧狀態(tài)下,HIF-la的表達(dá)可以上調(diào)MICA基因的轉(zhuǎn)錄水平。 3.在缺氧再給氧的0h時(shí),缺氧組的HK-2細(xì)胞中HIF-1a mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相比正常條件下培養(yǎng)的對(duì)照組上調(diào)明顯,并在4h時(shí)持續(xù)升高,在在8h開始下降,16h后即恢復(fù)至正常培養(yǎng)條件下的對(duì)照組水平。而在HIF-1a siRNA處理組中,0-16h內(nèi)HIF-1a的mRNA表達(dá)水平和對(duì)照組一直沒有明顯的變化和差異,說明對(duì)HIF-1a轉(zhuǎn)錄水平的沉默抑制效果明顯；并且陰性對(duì)照siRNA處理組中的HIF-1a mRNA的變化情況同缺氧組基本一致,說明轉(zhuǎn)染siRNA本身不能抑制HIF-1a mRNA的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。免疫熒光的結(jié)果也顯示,在缺氧再給氧的0h時(shí),在缺氧組和陰性siRNA處理組中檢測(cè)到明顯的HIF-1a蛋白表達(dá),而HIF-1a siRNA處理組和正常培養(yǎng)條件下的對(duì)照組中則幾乎檢測(cè)不到HIF-1a蛋白的表達(dá)。 4.在缺氧再給氧的0h時(shí),缺氧組的HK-2細(xì)胞中MICA mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相比正常條件下培養(yǎng)的對(duì)照組上調(diào)明顯,并在4h時(shí)持續(xù)升高,在8h開始下降,16h后即恢復(fù)至正常培養(yǎng)條件下的對(duì)照組水平,該表達(dá)變化趨勢(shì)和HIF-1a基因基本一致。而在HIF-1a siRNA處理組中,0-16h內(nèi)MICA的mRNA表達(dá)水平和正常條件下培養(yǎng)的對(duì)照組一直沒有明顯的變化和差異,說明缺氧再給氧過程中對(duì)HIF-1a基因的抑制明顯導(dǎo)致了MICA轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)；另一方面,因?yàn)殛幮詫?duì)照siRNA處理組中的MICA mRNA的變化情況同缺氧組基本一致,說明轉(zhuǎn)染siRNA本身不能影響MICA mRNA的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。 結(jié)論 HIF-la對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞缺氧再給氧過程中MICA表達(dá)有重要調(diào)控作用。
【關(guān)鍵詞】：HIF-1α 主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ相關(guān)抗原基因A 腎小管上皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 目錄11-13
• 中英文縮略詞13-14
• 前言14-16
• 技術(shù)路線圖15-16
• 材料與方法16-27
• 1 材料16-19
• 1.1 腎近曲小管上皮細(xì)胞系的培養(yǎng)16
• 1.2 重組腺病毒的擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定16-17
• 1.3 常氧狀態(tài)下腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α過表達(dá)對(duì)MICA基因表達(dá)的影響17-18
• 1.4 缺氧再給氧條件下HIF-1α對(duì)MICA基因表達(dá)的影響18-19
• 2 方法19-27
• 2.1 腎近曲小管上皮細(xì)胞系的培養(yǎng)19-20
• 2.2 重組腺病毒的擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定20-22
• 2.3 常氧狀態(tài)下腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α過表達(dá)對(duì)MICA基因表達(dá)的影響22-25
• 2.4 缺氧再給氧條件下HIF-1α對(duì)MICA基因表達(dá)的影響25-27
• 結(jié)果27-40
• 1 腎近曲小管上皮細(xì)胞系的培養(yǎng)27-28
• 1.1 腎小管上皮細(xì)胞系形態(tài)27
• 1.2 缺氧再給氧狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞系形態(tài)27-28
• 2 重組腺病毒的擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定28-29
• 2.1 重組腺病毒的擴(kuò)增28-29
• 2.2 重組腺病毒滴度的測(cè)定29
• 3 常氧狀態(tài)下腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α過表達(dá)對(duì)MICA基因表達(dá)的影響29-35
• 3.1 常氧狀態(tài)下腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α△ODD可在HK-2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)并發(fā)揮正常的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能29-34
• 3.2 常氧狀態(tài)下腺病毒介導(dǎo)的Ad.CMV.HIF-1α和Ad.CMV.HIF-1α△ODD可顯著上調(diào)MICA的轉(zhuǎn)錄水平34-35
• 4 缺氧再給氧條件下HIF-1α對(duì)MICA基因表達(dá)的影響35-40
• 4.1 缺氧再給氧條件下HIF-1α的表達(dá)明顯上調(diào),且HIF-1α siRNA干擾的處理對(duì)其抑制明顯35-38
• 4.2 在缺氧再給氧過程中MICA的表達(dá)明顯上調(diào),而該過程中HIF-1α 的抑制可導(dǎo)致MICA表達(dá)的下調(diào)38-40
• 討論40-45
• 1 腎近曲小管上皮細(xì)胞系的培養(yǎng)40
• 2 重組腺病毒的擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定40-42
• 3 常氧狀態(tài)下腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α 過表達(dá)對(duì)MICA基因表達(dá)的影響42-43
• 4 缺氧再給氧條件下HIF-1α 對(duì)MICA基因表達(dá)的影響43-45
• 小結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 綜述 MICA基因在腎移植中的應(yīng)用進(jìn)展50-57
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷57-58
• 致謝58

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 于立新;張新科;羅敏;肖露露;徐健;杜傳福;劉如敏;;腎移植受者術(shù)前主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類鏈相關(guān)基因A抗體對(duì)移植后早期急性排斥反應(yīng)的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年05期

2 涂陽科,楊敏,尹廣;影響腎移植遠(yuǎn)期預(yù)后的主要因素[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2000年01期

3 張t

本文編號(hào)：322604