丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）的感染呈世界性分布，能引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌。目前，全球HCV感染者1.7～2億人，我國(guó)一般人群HCV感染率約為2％，約3800萬(wàn)HCV感染者。成人感染者約50％～80％發(fā)展成慢性，其中約20％可發(fā)展為肝硬化，1％～4％可發(fā)展為肝癌。由于目前無(wú)HCV疫苗預(yù)防感染，而且，干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療的應(yīng)答率約為40％，因此，研制HCV疫苗具有重要的意義。HCV基因組全長(zhǎng)一般在9379～9481nt之間，編碼一個(gè)約含3000個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，在宿主和病毒自身蛋白酶的加工下產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白（C、E1和E2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2、NS3、NS4和NS5等）。HCV感染的最大病理特點(diǎn)為：慢性感染者體內(nèi)的免疫反應(yīng)不能有效清除病毒體，病毒以準(zhǔn)毒株（quasispecies）形式存在于宿主體內(nèi)。本研究針對(duì)HCV的高度變異及免疫學(xué)特點(diǎn)，首先設(shè)計(jì)合成出HCV多表位抗原基因（multi-epitope fragment combination，mfc），將其同gst基因融合后原核表達(dá)，獲得了HCV多表位抗原融合蛋白GST-MFC，分析了HCV... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

多表位抗原融合蛋白GST-MFC在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.1一3TlleexPressionofGST-MFCProteioinESche月‘h扭coltBL21口E3)

見(jiàn)相對(duì)分子量約為57.6KDa的多表位抗原融合蛋白GST-MFC的表達(dá)，與設(shè)計(jì)完全相符。高效表達(dá)的重組菌能表達(dá)可溶性多表位抗原融合蛋白約占菌體蛋白的l~5%，見(jiàn)圖1一3。經(jīng)過(guò)對(duì)起始誘導(dǎo)的菌液濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間的分析，最終確定在搖瓶中發(fā)酵表達(dá)可溶性多表位抗原融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件見(jiàn)表1一3。圖1一3多表位抗原融合蛋白GST-MFC在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.1一3TlleexPressionofGST-MFCProteioinESche月‘h扭coltBL21口E3)LanelandIine10:Marker;Lane2andlane4:ExPress宜onofPGEX-4T-1in2eontrolreeombinants:Lane3andlanes~laneg:ExPressionofPGEX-4T-MFCin6reeombinants.表1一3誘導(dǎo)可溶性多表位抗原融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的最適條件Tablel·3TheoPtimaleonditionsofthoexPressionofsolubleGST·MFCProteinIPTG濃度0.6mmol/L起始誘導(dǎo)的菌液濃度誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)時(shí)間1.0左右28℃搖床轉(zhuǎn)速220rpn口min2.2多表位抗原融合蛋白的親和層析純化及蛋白濃度測(cè)定在多表位抗原融合蛋白的親和層析純化中，為獲得更多的可溶蛋白，我們嘗試在超聲破碎菌體時(shí)加入溶菌酶或Tritonx·100或DTr，發(fā)現(xiàn)加入溶菌酶和TritonX一100雖然可以使細(xì)菌幾乎完全破碎，但是，卻在后期純化中得不到可溶性多表位抗原融合蛋白，而加入D竹可略微增加可溶蛋白的獲得.同時(shí)，我們嘗試分別用1011111101幾、20mmol/L及3Omm。比的還原性谷朧甘膚(溶于son”no比Tris一HCI，PHS.0)來(lái)洗脫多表位抗原融合蛋白

用丙肝患者陽(yáng)性血清(l:10稀釋)作為一抗，用HRp.兔抗人lgG(1:1000稀釋)作為二抗，Westemblot雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，丙肝患者陽(yáng)性血清可特異性識(shí)別多表位抗原融合蛋白，而不識(shí)別單純的GST蛋白，見(jiàn)圖1·5。結(jié)果表明，MFC蛋白具有模擬HCV某些抗原表位的特性，推測(cè)主要為HVRI區(qū)的中和表位。但是，我們發(fā)現(xiàn)多數(shù)丙肝患者陽(yáng)性血清稀釋到1:200以上，幾乎不能檢測(cè)到雜交帶，提示丙肝患者陽(yáng)性血清中的抗HVRI抗體滴度較低。圖1一SW七sternblot雜交檢側(cè)內(nèi)肝思者陽(yáng)性血清別識(shí)HCV多表位抗原融合蛋白GST-MFC反應(yīng)Fig.1一5叭陽(yáng)sternblotofGST-MFCProteinWithanti-HCVseru口1:BSA;2:GST-MFC2.5INSIGHTll和DNAM[AN的分析2.5.1INSIGHTll軟件分析結(jié)果本研究表達(dá)的MFC蛋白是完全人工設(shè)計(jì)的，對(duì)其空間構(gòu)象的預(yù)測(cè)具有科學(xué)意義，并可為進(jìn)一步研究提供幫助。Insishtn軟件包的seqFold模塊是序列同結(jié)構(gòu)相似性的打分函數(shù)，由于se叮old基于序列和結(jié)構(gòu)二者的兼容性


本文編號(hào)：3209656