丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）的感染呈世界性分布，能引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝細胞癌。目前，全球HCV感染者1.7～2億人，我國一般人群HCV感染率約為2％，約3800萬HCV感染者。成人感染者約50％～80％發(fā)展成慢性，其中約20％可發(fā)展為肝硬化，1％～4％可發(fā)展為肝癌。由于目前無HCV疫苗預(yù)防感染，而且，干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療的應(yīng)答率約為40％，因此，研制HCV疫苗具有重要的意義。HCV基因組全長一般在9379～9481nt之間，編碼一個約含3000個氨基酸的多聚蛋白前體，在宿主和病毒自身蛋白酶的加工下產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白（C、E1和E2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2、NS3、NS4和NS5等）。HCV感染的最大病理特點為：慢性感染者體內(nèi)的免疫反應(yīng)不能有效清除病毒體，病毒以準毒株（quasispecies）形式存在于宿主體內(nèi)。本研究針對HCV的高度變異及免疫學(xué)特點，首先設(shè)計合成出HCV多表位抗原基因（multi-epitope fragment combination，mfc），將其同gst基因融合后原核表達，獲得了HCV多表位抗原融合蛋白GST-MFC，分析了HCV... 

【文章來源】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

多表位抗原融合蛋白GST-MFC在大腸桿菌中的表達Fig.1一3TlleexPressionofGST-MFCProteioinESche月‘h扭coltBL21口E3)

見相對分子量約為57.6KDa的多表位抗原融合蛋白GST-MFC的表達，與設(shè)計完全相符。高效表達的重組菌能表達可溶性多表位抗原融合蛋白約占菌體蛋白的l~5%，見圖1一3。經(jīng)過對起始誘導(dǎo)的菌液濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時間的分析，最終確定在搖瓶中發(fā)酵表達可溶性多表位抗原融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件見表1一3。圖1一3多表位抗原融合蛋白GST-MFC在大腸桿菌中的表達Fig.1一3TlleexPressionofGST-MFCProteioinESche月‘h扭coltBL21口E3)LanelandIine10:Marker;Lane2andlane4:ExPress宜onofPGEX-4T-1in2eontrolreeombinants:Lane3andlanes~laneg:ExPressionofPGEX-4T-MFCin6reeombinants.表1一3誘導(dǎo)可溶性多表位抗原融合蛋白在大腸桿菌中表達的最適條件Tablel·3TheoPtimaleonditionsofthoexPressionofsolubleGST·MFCProteinIPTG濃度0.6mmol/L起始誘導(dǎo)的菌液濃度誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)時間1.0左右28℃搖床轉(zhuǎn)速220rpn口min2.2多表位抗原融合蛋白的親和層析純化及蛋白濃度測定在多表位抗原融合蛋白的親和層析純化中，為獲得更多的可溶蛋白，我們嘗試在超聲破碎菌體時加入溶菌酶或Tritonx·100或DTr，發(fā)現(xiàn)加入溶菌酶和TritonX一100雖然可以使細菌幾乎完全破碎，但是，卻在后期純化中得不到可溶性多表位抗原融合蛋白，而加入D竹可略微增加可溶蛋白的獲得.同時，我們嘗試分別用1011111101幾、20mmol/L及3Omm。比的還原性谷朧甘膚(溶于son”no比Tris一HCI，PHS.0)來洗脫多表位抗原融合蛋白

用丙肝患者陽性血清(l:10稀釋)作為一抗，用HRp.兔抗人lgG(1:1000稀釋)作為二抗，Westemblot雜交檢測發(fā)現(xiàn)，丙肝患者陽性血清可特異性識別多表位抗原融合蛋白，而不識別單純的GST蛋白，見圖1·5。結(jié)果表明，MFC蛋白具有模擬HCV某些抗原表位的特性，推測主要為HVRI區(qū)的中和表位。但是，我們發(fā)現(xiàn)多數(shù)丙肝患者陽性血清稀釋到1:200以上，幾乎不能檢測到雜交帶，提示丙肝患者陽性血清中的抗HVRI抗體滴度較低。圖1一SW七sternblot雜交檢側(cè)內(nèi)肝思者陽性血清別識HCV多表位抗原融合蛋白GST-MFC反應(yīng)Fig.1一5叭陽sternblotofGST-MFCProteinWithanti-HCVseru口1:BSA;2:GST-MFC2.5INSIGHTll和DNAM[AN的分析2.5.1INSIGHTll軟件分析結(jié)果本研究表達的MFC蛋白是完全人工設(shè)計的，對其空間構(gòu)象的預(yù)測具有科學(xué)意義，并可為進一步研究提供幫助。Insishtn軟件包的seqFold模塊是序列同結(jié)構(gòu)相似性的打分函數(shù)，由于se叮old基于序列和結(jié)構(gòu)二者的兼容性


本文編號：3209656