本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌毒力和E.coli體內(nèi)生物膜形成的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：在自然界細菌以單個游離懸浮狀態(tài)和生物膜（biofilm，BF）狀態(tài)兩種形式存在。與浮游細菌相比，處于BF狀態(tài)的細菌對不利條件，如干燥、極端溫度、抗菌藥物和消毒劑的抵抗力均明顯增強。感染了BF的機體和污染了BF的生物材料，即使應(yīng)用正常劑量數(shù)百倍的抗菌藥物也難以奏效，因而常導(dǎo)致遷延難治性感染或嚴重公共衛(wèi)生事件。傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98是一種同時編碼細菌耐藥性和毒力的“嵌合性”質(zhì)粒，在實驗室和小鼠體內(nèi)很容易通過接合作用從傷寒沙門菌（Salmonella typhi, S. typhi, ST）傳遞至鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium, S.typhimurium, STM）、大腸埃希菌（Escherichia coli, E. coli）和痢疾桿菌等，且這些細菌彼此之間還可互相傳遞，導(dǎo)致宿主菌耐藥性和毒力增強。由于傷寒沙門菌只感染人類，沒有合適的動物模型，因此在本課題中，通過接合轉(zhuǎn)移將pRST98分別轉(zhuǎn)移至受體菌形成接合子STM/pRST98和E. coli/pRST98進行研究。本研究第一部分探討傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌毒力的影響，比較受試菌STM，STM/pRST98，E. coli和E. coli/pRST98在浮游狀態(tài)和BF狀態(tài)下，細菌粘附侵襲、抵抗血清殺菌和巨噬細胞吞噬能力的的差異。本研究第二部分以E. coli和E.coli/pRST98為研究對象，通過構(gòu)建小鼠泌尿道插管模型，研究傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98對E. coli在小鼠體內(nèi)形成BF的影響。 方法： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌毒力的影響 1.不同狀態(tài)下細菌菌液的準備 按常規(guī)方法將受試菌STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli/pRST98增菌，制備單個游離懸浮狀態(tài)的細菌菌液；將受試菌分別在常規(guī)條件下培養(yǎng)3d形成成熟BF，使用超聲法將BF中的細菌均勻分散后，制備BF狀態(tài)下的菌液。將游離細菌與BF細菌使用OD法和平板菌落計數(shù)法（colony-forming unit, CFU）確定濃度后，分別與小鼠結(jié)腸癌細胞CT26進行粘附侵襲、血清殺菌以及抗巨噬細胞吞噬實驗，分別比較不同狀態(tài)下受試菌毒力的差異以及pRST98對不同狀態(tài)下宿主菌毒力的影響。 2.傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌粘附和侵襲CT26細胞的影響 將實驗菌株STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli/pRST98按感染復(fù)數(shù)（multiplicityof infection, MOI）100:1與CT26細胞共培養(yǎng)1h后，棄去菌液后用PBS洗滌細胞，破膜后用CFU比較受試菌對細胞的粘附力。侵襲實驗與粘附實驗基本相同，但在細菌細胞共培養(yǎng)1h后棄去菌液用PBS洗滌3次后每孔加入含阿米卡星（100μg/ml）的細胞培養(yǎng)液，作用3h后進行細胞內(nèi)活菌計數(shù)。 3.傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌抵抗血清殺菌能力的影響 用OD法和CFU法將不同狀態(tài)的受試菌稀釋至1×104CFU/ml，吸取20μl菌液分別加入含不同稀釋度的兔和豚鼠血清0.2ml的試管，不含血清的普通肉湯管做CFU對照，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇37℃，2h作為殺菌作用時間。用平板菌落計數(shù)法計算存活細菌數(shù)。 4.傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌抵抗巨噬細胞吞噬殺傷的影響 STM作為兼性厭氧胞內(nèi)菌，可在巨噬細胞內(nèi)存活。用OD法和CFU法將浮游狀態(tài)和BF狀態(tài)下受試菌濃度調(diào)整至107CFU/ml待用。用血細胞計數(shù)板計數(shù)后將小鼠巨噬細胞J774A.1細胞濃度調(diào)整至5×105個/ml，分別加入6孔板，每孔1ml。將1ml不同狀態(tài)的受試菌加入到各孔中，與細胞共作用1h。用含阿米卡星（100μg/ml）的RPMI1640培養(yǎng)液離心洗滌除去胞外菌，重新懸浮于含阿米卡星的培養(yǎng)液中，在不同時間點裂解細胞做CFU檢測胞內(nèi)活菌數(shù)。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對E. coli體內(nèi)生物膜形成的影響 1.小鼠泌尿道插管模型的制備 PE10塑料導(dǎo)管經(jīng)消毒處理后分別于1×107CFU/ml的E. coli和E. coli/pRST98菌液中浸潤24h，使受試菌粘附于導(dǎo)管表面。雌鼠進行麻醉、固定及消毒后，將準備好的PE10導(dǎo)管插入小鼠尿道并輕推至膀胱中。根據(jù)感染細菌的不同將小鼠分為兩組，每組6只，實驗重復(fù)3次。 2.比較E. coli和E. coli/pRST98在體內(nèi)形成BF的差異 （1）激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope， CLSM）觀察導(dǎo)管表面BF的形成 感染后第5d小鼠經(jīng)麻醉處死，將PE10導(dǎo)管從體內(nèi)取出后用PBS洗滌，置于適量濃度為0.01%的吖啶橙染液中，于黑暗中靜置染色10min再用PBS洗滌，將染色的導(dǎo)管置于載玻片上鏡下觀察。 (2)掃描電鏡（Scanning electron microscopy, SEM）觀察導(dǎo)管表面生物膜的形成 將插管后第5天的小鼠麻醉后處死，取出膀胱中的PE10導(dǎo)管，用PBS輕柔洗滌，用2.5%的戊二醛溶液固定，用0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液漂洗后，用1%鋨酸后固定1h，再用連續(xù)梯度的叔丁醇溶液脫水，將導(dǎo)管取出進行臨界點干燥和鍍金后于SEM下觀察導(dǎo)管表面BF的形態(tài)。 (3)生物膜CFU計數(shù) 按上述方法取得導(dǎo)管后，經(jīng)PBS輕柔漂洗后置于1.0ml PBS超聲振動20min，使生物膜中的細菌均勻分散至溶液中，進行CFU計數(shù)生物膜中的活菌數(shù)量。 3.受試菌感染后小鼠臟器的變化 插入導(dǎo)管后第8d經(jīng)麻醉處死小鼠，肉眼觀察小鼠的肝臟、腎臟和脾臟的病變。取其肝臟和腎臟固定于10%的甲醛中，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等步驟，切片經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察。 結(jié)果： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌毒力的影響 1.傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下受試菌粘附和侵襲的影響 實驗結(jié)果顯示除E. coli外，各受試菌在BF狀態(tài)下對細胞的粘附力明顯增強，在BF狀態(tài)和浮游狀態(tài)下，pRST98對宿主細菌的粘附力無明顯影響（p0.05）。在兩種不同狀態(tài)下，與E. coli相比，STM對CT26細胞的粘附力更強。侵襲實驗結(jié)果表明，形成BF后STM對CT26細胞的侵襲力明顯下降(p 0.01)，E. coli組，也有相似趨勢(p 0.05)。另外，pRST98在BF和浮游狀態(tài)下對宿主菌侵襲CT26細胞的能力均無明顯影響。STM對CT26細胞的侵襲能力強于E. coli(p 0.05)。 2.傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下受試菌抵抗血清殺菌能力的影響 BF狀態(tài)的受試菌STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli pRST98在兔血清和豚鼠血清中的存活率均高于浮游狀態(tài)的受試菌(p 0.05)。在BF狀態(tài)下，STM/pRST98和E.coli pRST98抗兔血清和豚鼠血清殺菌能力亦分別明顯高于STM和E. coli(p 0.05)。STM對血清殺菌的抵抗力顯著高于E. coli(p 0.05)。 3.傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下受試菌抵抗巨噬細胞吞噬殺傷的影響 BF狀態(tài)下的STM在巨噬細胞內(nèi)的存活率明顯高于浮游狀態(tài)下的細菌，說明在BF狀態(tài)下細菌抗巨噬細胞吞噬能力增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p 0.05）。另外，可以發(fā)現(xiàn)BF和浮游狀態(tài)下，STM pRST98在巨噬細胞內(nèi)的存活率均高于STM（p 0.05）。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對E. coli體內(nèi)生物膜形成的影響 1.比較E. coli和E. coli/pRST98在體內(nèi)形成BF的差異 成功建立小鼠插管模型。小鼠插管后活動正常，麻醉后處死小鼠從小鼠膀胱中取出導(dǎo)管。插管后第5d，E. coli和E. coli/pRST98可以在導(dǎo)管上形成BF，通過CLSM可以觀察到E. coli/pRST98在導(dǎo)管表面形成的BF熒光信號明顯強于E. coli。SEM下觀察導(dǎo)管表面形成的生物膜發(fā)現(xiàn)，E. coli/pRST98感染組細菌聚集成團，形成成片的BF，，而E. coli感染組細菌只是散落分布于導(dǎo)管表面不能形成明顯的BF。CFU定量檢測導(dǎo)管表面活菌數(shù)結(jié)果顯示，E. coli/pRST98在導(dǎo)管上的定值數(shù)量明顯高于E. coli（p 0.05）。 2.受試菌感染后小鼠臟器的變化 E. coli/pRST98感染組小鼠皮毛黯淡，精神萎靡，活動遲緩。感染后第8d將小鼠麻醉處死解剖后見小鼠肝臟、腎臟和脾臟明顯充血腫大，表面有多發(fā)性小膿腫；病理切片HE染色后見小鼠肝臟細胞濁腫，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞且有炎性細胞浸潤，腎臟有大量淋巴細胞浸潤，腎小球結(jié)構(gòu)破壞。E. coli感染組小鼠皮毛、精神及活動均正常，感染后第8d將小鼠麻醉處死解剖后見小鼠肝臟、腎臟和脾臟稍腫大，但無多發(fā)性小膿腫；病理切片HE染色可見小鼠肝細胞水樣變性和炎癥細胞浸潤，腎臟細胞水樣變性及淋巴細胞浸潤。 結(jié)論： 1. BF的形成在促進細菌對小鼠結(jié)腸癌細胞CT26粘附的同時降低了細菌對細胞的侵襲。 2. BF形成能顯著增強細菌抵抗血清殺菌和巨噬細胞吞噬的能力，使毒力增強。 3.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98能增強浮游和BF狀態(tài)下STM和E. coli對血清殺菌和巨噬細胞吞噬的抵抗力。 4.傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98能促進E. coli在小鼠體內(nèi)形成BF。
【關(guān)鍵詞】：鼠傷寒沙門菌 大腸埃希菌 生物膜 傷寒沙門菌質(zhì)粒 小鼠模型
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.22
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-14
• 第一部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌毒力的影響14-29
• 前言14-16
• 1 材料與方法16-22
• 1.1 材料16-19
• 1.2 方法19-22
• 2 結(jié)果22-26
• 2.1 傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下受試菌粘附 CT26 細胞的影響22
• 2.2 傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下受試菌侵襲 CT26 細胞的影響22-23
• 2.3 傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下受試菌抵抗血清殺菌能力的影響23-25
• 2.4 傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌抵抗巨噬細胞吞噬殺傷的影響25-26
• 3 討論26-29
• 第二部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對 E. coli 體內(nèi)生物膜形成的影響29-39
• 1 材料與方法30-33
• 1.1 材料30-31
• 1.2 方法31-33
• 2. 結(jié)果33-36
• 2.1 CLSM 觀察導(dǎo)管表面細菌生物膜的形成33
• 2.2 SEM 觀察導(dǎo)管表面細菌細菌生物膜的形成33-34
• 2.3 生物膜 CFU 計數(shù)34-35
• 2.4 受試菌感染后小鼠臟器的變化35-36
• 3 討論36-39
• 小結(jié)39-40
• 參考文獻40-44
• 綜述44-60
• References54-60
• 英文縮略詞表60-61
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文61-62
• 本課題所獲基金資助62-63
• 致謝63-64

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃瑞，穆榮譜;傷寒沙門氏菌耐藥性及其耐藥質(zhì)粒的監(jiān)測[J];中華傳染病雜志;1994年04期

  本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌質(zhì)粒對不同狀態(tài)下細菌毒力和E.coli體內(nèi)生物膜形成的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：319189