本文關(guān)鍵詞：酵母雙雜交技術(shù)篩選CT813配體的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis, CT）是一類嚴(yán)格活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，具有獨(dú)特二相發(fā)育周期的原核微生物，發(fā)育周期即原體→始體→原體，原體代謝能力弱但感染性強(qiáng)，始體代謝能力強(qiáng)但沒(méi)感染性。沙眼衣原體主要引起沙眼疾病，是全球致盲的首要病因；可通過(guò)性傳播途徑，，引起人類泌尿生殖道感染；也可侵犯腹股溝淋巴結(jié)，引起化膿性淋巴結(jié)炎和慢性淋巴肉芽腫，嚴(yán)重危害人類健康。 CT的生物合成和裝配是包涵體內(nèi)進(jìn)行的，包涵體不僅為沙眼衣原體復(fù)制提供微環(huán)境，而且保護(hù)CT免遭宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除。另外包涵體膜是CT從宿主細(xì)胞中攝取營(yíng)養(yǎng)和代謝的中間產(chǎn)物以及信號(hào)變換的必經(jīng)之路。包涵體膜的主要組成成分是由CT基因編碼、表達(dá)于包涵體膜上的蛋白質(zhì)即包涵體膜蛋白。自從Rochey等【1995年】用實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)衣原體通過(guò)轉(zhuǎn)位其自身基因編碼的蛋白到包涵體膜上以來(lái)，不斷有新的包涵體膜蛋白被鑒定出來(lái)。根據(jù)已經(jīng)鑒定的膜蛋白的疏水性特性，計(jì)算機(jī)輔助程序預(yù)測(cè)出36個(gè)CT基因編碼的蛋白為候選包涵體膜蛋白。CT813是被預(yù)測(cè)并經(jīng)過(guò)證實(shí)的包涵體膜蛋白之一，但對(duì)CT813的具體生物學(xué)功能尚不清楚，為此我們用酵母雙雜交技術(shù)尋找與CT813相互作用的蛋白，以期為進(jìn)一步深入研究CT813的生物學(xué)特性及闡述沙眼衣原體的致病機(jī)制提供重要信息。 首先，根據(jù)STD基因庫(kù)（www.stdgen. lanl. gov）提供信息設(shè)計(jì)引物，用PCR法從沙眼衣原體的D型菌株中獲取目的基因片段CT813，用限制性內(nèi)切酶Sma I和Pst I酶切處理CT813和pGBKT7質(zhì)粒，經(jīng)T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli, BL-21中培養(yǎng)。用菌落PCR、Sma I/Pst I雙酶切驗(yàn)證后，對(duì)確認(rèn)的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，使用BLAST軟件比對(duì)分析。將構(gòu)建成功的誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109和Y187中，經(jīng)檢證無(wú)自激活和細(xì)胞毒性作用。 以pGBKT7-CT813作為誘餌質(zhì)粒與HeLa細(xì)胞酵母GAL4AD融合cDNA文庫(kù)進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。待三葉草（或米奇）形狀合子形成后，涂布于缺腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸、色氨酸缺陷型培養(yǎng)基并鋪有X-Gal（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-Gal）的平板上初篩，經(jīng)過(guò)3次篩選收集陽(yáng)性菌落。把陽(yáng)性菌液點(diǎn)種在濾紙上，在液氮中反復(fù)凍融3次，然后浸泡在Z緩沖液-β巰基乙醇-X-Gal混合液中室溫溫育8h。篩選出的陽(yáng)性菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將克隆陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行回交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行堿基序列測(cè)定，經(jīng)BLAST比對(duì)檢測(cè)其同源蛋白，確定篩選基因。經(jīng)過(guò)檢索比對(duì)得出與pGBKT7-CT813特異性相互作用的蛋白有：半乳糖凝集素-1（LGALS1）、環(huán)腺苷酸應(yīng)答原件結(jié)合蛋白3（CREB3）、核糖體核糖體蛋白L10a（RPL10a）、微管蛋白37E-16（RP1-37E16）。
【關(guān)鍵詞】：cDNA文庫(kù) HeLa細(xì)胞 包涵體膜蛋白 誘餌載體 酵母雙雜交
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R374.1;R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英文縮寫8-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-27
• 結(jié)果27-29
• 附圖29-39
• 附表39-40
• 討論40-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 綜述51-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 致謝59-60
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 周麗娜;吳軍;羅高興;賀偉峰;陳希煒;柏甘萍;石東文;王慶紅;袁順宗;張小容;胡曉紅;;Foxp3酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定和其毒性及自激活效應(yīng)檢測(cè)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2006年08期

2 ;Screening of FOXP3-interacted proteins by yeast two-hybrid technique[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2008年02期

  本文關(guān)鍵詞：酵母雙雜交技術(shù)篩選CT813配體的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：315817