本文關鍵詞：酵母雙雜交技術篩選CT813配體的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis, CT）是一類嚴格活細胞內生長，具有獨特二相發(fā)育周期的原核微生物，發(fā)育周期即原體→始體→原體，原體代謝能力弱但感染性強，始體代謝能力強但沒感染性。沙眼衣原體主要引起沙眼疾病，是全球致盲的首要病因；可通過性傳播途徑，，引起人類泌尿生殖道感染；也可侵犯腹股溝淋巴結，引起化膿性淋巴結炎和慢性淋巴肉芽腫，嚴重危害人類健康。 CT的生物合成和裝配是包涵體內進行的，包涵體不僅為沙眼衣原體復制提供微環(huán)境，而且保護CT免遭宿主免疫系統(tǒng)的識別和清除。另外包涵體膜是CT從宿主細胞中攝取營養(yǎng)和代謝的中間產物以及信號變換的必經(jīng)之路。包涵體膜的主要組成成分是由CT基因編碼、表達于包涵體膜上的蛋白質即包涵體膜蛋白。自從Rochey等【1995年】用實驗首次證實衣原體通過轉位其自身基因編碼的蛋白到包涵體膜上以來，不斷有新的包涵體膜蛋白被鑒定出來。根據(jù)已經(jīng)鑒定的膜蛋白的疏水性特性，計算機輔助程序預測出36個CT基因編碼的蛋白為候選包涵體膜蛋白。CT813是被預測并經(jīng)過證實的包涵體膜蛋白之一，但對CT813的具體生物學功能尚不清楚，為此我們用酵母雙雜交技術尋找與CT813相互作用的蛋白，以期為進一步深入研究CT813的生物學特性及闡述沙眼衣原體的致病機制提供重要信息。 首先，根據(jù)STD基因庫（www.stdgen. lanl. gov）提供信息設計引物，用PCR法從沙眼衣原體的D型菌株中獲取目的基因片段CT813，用限制性內切酶Sma I和Pst I酶切處理CT813和pGBKT7質粒，經(jīng)T4連接酶連接，轉入感受態(tài)細胞E.coli, BL-21中培養(yǎng)。用菌落PCR、Sma I/Pst I雙酶切驗證后，對確認的陽性質粒進行測序，使用BLAST軟件比對分析。將構建成功的誘餌質粒轉入酵母菌株AH109和Y187中，經(jīng)檢證無自激活和細胞毒性作用。 以pGBKT7-CT813作為誘餌質粒與HeLa細胞酵母GAL4AD融合cDNA文庫進行酵母雙雜交實驗。待三葉草（或米奇）形狀合子形成后，涂布于缺腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸、色氨酸缺陷型培養(yǎng)基并鋪有X-Gal（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-Gal）的平板上初篩，經(jīng)過3次篩選收集陽性菌落。把陽性菌液點種在濾紙上，在液氮中反復凍融3次，然后浸泡在Z緩沖液-β巰基乙醇-X-Gal混合液中室溫溫育8h。篩選出的陽性菌液進行PCR驗證。將克隆陽性的菌液提取質粒進行回交實驗驗證。對陽性質粒進行堿基序列測定，經(jīng)BLAST比對檢測其同源蛋白，確定篩選基因。經(jīng)過檢索比對得出與pGBKT7-CT813特異性相互作用的蛋白有：半乳糖凝集素-1（LGALS1）、環(huán)腺苷酸應答原件結合蛋白3（CREB3）、核糖體核糖體蛋白L10a（RPL10a）、微管蛋白37E-16（RP1-37E16）。
【關鍵詞】：cDNA文庫 HeLa細胞 包涵體膜蛋白 誘餌載體 酵母雙雜交
【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R374.1;R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英文縮寫8-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-27
• 結果27-29
• 附圖29-39
• 附表39-40
• 討論40-44
• 結論44-45
• 參考文獻45-51
• 綜述51-59
• 參考文獻55-59
• 致謝59-60
• 個人簡歷60

【參考文獻】

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1 周麗娜;吳軍;羅高興;賀偉峰;陳希煒;柏甘萍;石東文;王慶紅;袁順宗;張小容;胡曉紅;;Foxp3酵母雙雜交誘餌表達載體的構建、鑒定和其毒性及自激活效應檢測[J];第三軍醫(yī)大學學報;2006年08期

2 ;Screening of FOXP3-interacted proteins by yeast two-hybrid technique[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2008年02期

  本文關鍵詞：酵母雙雜交技術篩選CT813配體的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：315817