本文關鍵詞：擬除蟲菊酯噬菌體抗體庫構建及基因工程抗體制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗體作為免疫分析的核心試劑,其制備技術一直是制約免疫分析法在農藥殘留分析中應用的瓶頸因素,因此尋求一種新的抗體制備方法對農殘免疫分析具有重要的意義。 本研究利用噬菌體抗體庫技術和基因工程技術,制備了擬除蟲菊酯單鏈抗體,并對抗體的結構特點及其與抗原的特異性作用進行了分析。首先,從分泌擬除蟲菊酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株2G2E7中提取總RNA,并反轉錄成cDNA。以cDNA為模板,利用兼并引物進行PCR擴增,獲得了長度約350bp的重鏈可變區(qū)基因和約325bp的輕鏈可變區(qū)基因,再經重疊延伸PCR獲得了750bp左右的單鏈抗體(scFv)基因。經過內切酶SfiⅠ和NotⅠ對scFv和pCANTAB5E載體進行酶切、連接和熱激法轉化大腸桿菌TG1,最終獲得了庫容大小2.3×107的擬除蟲菊酯初級抗體庫,陽性率為100%。利用抗原對抗體庫進行淘選,通過五輪淘選,有效地富集了擬除蟲菊酯特異性噬菌體抗體,第五輪淘選后的噬菌體陽性率為95%；隨機挑取五輪淘選后的單克隆進行測序,得到3個scFv基因。將3個基因進行PCR擴增、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后,與pET-26b載體進行連接,成功構建重組表達載體scFv-pET26b。將重組質粒轉入表達菌株BL21,最終得到3個scFv-pET26b重組表達菌株。對表達條件進行優(yōu)化,經超聲破碎及SDS-PAGE檢測,結果顯示在0.1mM IPTG,200rpm,25℃低溫誘導12h條件下,3個scFv蛋白能成功表達,重組蛋白主要以包涵體的形式存在于細胞內,少量以可溶形式存在。利用間接競爭ELISA初步鑒定3個scFv的活性,結果表明：擬除蟲菊酯2號單鏈抗體(PBAscFv2)對氰戊菊酯具有一定的結合活性,10μg/mL標品濃度下抑制率約為20%。序列分析結果顯示PBAscFv2蛋白共245個氨基酸,重鏈123個氨基酸,輕鏈107個氨基酸,柔性連接肽15個氨基酸；經SOPMA軟件分析,PBAscFv2二級結構中含α螺旋21處,p折疊109處,p轉角23處,隨機卷曲92處；利用CPH models3.2Server對PBAscFv2的空間結構進行模擬,并利用Discovery Studio2.5軟件將PBAscFv2與氰戊菊酯分子進行對接,結果顯示抗原抗體結合區(qū)域由三部分構成：①抗體重鏈高可變區(qū)CDR3區(qū)(VH-CDR3)殘基Met106、Asp107、Tyr108和Trp109；②輕鏈框架Ⅲ區(qū)(VL-FR3)殘基Thr91和Ser92；③輕鏈高可變區(qū)CDR2區(qū)(VL-CDR2)殘基Ala41、Ser42和Pro43。 本研究的開展為擬除蟲菊酯類農藥基因工程抗體的制備、及其在ELISA檢測方法中的應用奠定了基礎。
【關鍵詞】：擬除蟲菊酯 噬菌體抗體庫 單鏈抗體 重組表達 間接競爭酶聯(lián)免疫分析
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-22
• 1.1 農藥殘留概述9-11
• 1.1.1 我國農藥殘留現(xiàn)狀9
• 1.1.2 農藥殘留的危害9-11
• 1.2 擬除蟲菊酯類農藥11-12
• 1.2.1 擬除蟲菊酯類農藥簡介11
• 1.2.2 擬除蟲菊酯類農藥的危害11-12
• 1.3 擬除蟲菊酯類農藥的檢測方法12-15
• 1.3.1 分光光度法12
• 1.3.2 色譜法12-14
• 1.3.3 免疫分析法14-15
• 1.4 基因工程抗體15-18
• 1.4.1 基因工程抗體簡介15-16
• 1.4.2 常見的幾種基因工程抗體16-18
• 1.5 噬菌體抗體庫技術18-20
• 1.5.1 噬菌體展示技術原理18-19
• 1.5.2 噬菌體抗體庫的種類19-20
• 1.5.3 噬菌體抗體庫應用現(xiàn)狀20
• 1.6 研究目的及意義20-21
• 1.7 研究內容21-22
• 2 材料和方法22-44
• 2.1 材料22-28
• 2.1.1 實驗用菌種及細胞22
• 2.1.2 實驗用工具酶及抗生素22
• 2.1.3 實驗用試劑及試劑盒22-24
• 2.1.4 實驗儀器24-25
• 2.1.5 PCR所用的引物25-26
• 2.1.6 主要溶液和培養(yǎng)基的配置方法26-28
• 2.2 實驗方法28-44
• 2.2.1 擬除蟲菊酯單克隆細胞總RNA的提取28-29
• 2.2.2 擬除蟲菊酯單鏈抗體基因的擴增29-33
• 2.2.3 噬菌體展示初級庫的構建33-36
• 2.2.4 淘選36-38
• 2.2.5 噬菌體ELISA38
• 2.2.6 菌落PCR驗證38-39
• 2.2.7 測序39
• 2.2.8 利用pCANTAB5E-PBAscFv-HB2151菌株表達單鏈抗體39-40
• 2.2.9 pET26b-PBAscFv-JM109菌株的制備40-42
• 2.2.10 利用pET26b-PBAscFv-BL21菌株表達單鏈抗體42-43
• 2.2.11 利用間接競爭ELISA初步鑒定單鏈抗體活性43
• 2.2.12 單鏈抗體一級結構和空間結構分析43-44
• 3 結果與討論44-61
• 3.1 實驗結果44-60
• 3.1.1 擬除蟲菊酯單克隆細胞總RNA的提取44
• 3.1.2 擬除蟲菊酯單鏈抗體基因的擴增44-46
• 3.1.3 噬菌體展示初級庫的構建46-47
• 3.1.4 淘選47-48
• 3.1.5 噬菌體ELISA48
• 3.1.6 菌落PCR驗證48
• 3.1.7 序列分析48-50
• 3.1.8 利用pCANTAB5E-PBAscFv-HB2151菌株表達單鏈抗體50-51
• 3.1.9 pET26b-PBAscFv-JM109菌株的制備51-54
• 3.1.10 利用pET26b-PBAscFv-BL21菌株表達單鏈抗體54-56
• 3.1.11 利用間接競爭ELISA初步鑒定單鏈抗體活性56-57
• 3.1.12 單鏈抗體一級結構和空間結構分析57-60
• 3.2 討論60-61
• 4 結論61-62
• 5 展望62-63
• 6 參考文獻63-70
• 7 致謝70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 查玉兵;陳美;王曉芳;劉麗麗;;農藥殘留分析技術研究進展[J];安徽農業(yè)科學;2007年23期

2 楊廣,劉新,鄢錚,尤民生;4種擬除蟲菊酯農藥的GC-MS和GC-MS/MS檢測[J];福建農業(yè)大學學報;2003年04期

3 李永夫;高華鵬;張健玲;應躍康;吳志云;容文欽;;超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定鰻魚中呋線威和溴氰菊酯殘留[J];分析化學;2008年06期

4 臧曉歡;王春;高書濤;周欣;王志;;分散液相微萃取-氣相色譜聯(lián)用分析水樣中菊酯類農藥殘留[J];分析化學;2008年06期

5 林子俺;龔巧燕;謝增鴻;;高效液相色譜測定蔬菜中擬除蟲菊酯類農藥殘留[J];福州大學學報(自然科學版);2008年01期

6 李昌龍;基因工程抗體的研究進展[J];國外醫(yī)學.臨床生物化學與檢驗學分冊;1995年01期

7 葛彥;人源化抗體研制策略分析及應用研究[J];國外醫(yī)學(免疫學分冊);2004年05期

8 秦靖;馬賽;胡薇;石磊;;農貿市場中蔬菜農藥殘留調查[J];中國公共衛(wèi)生管理;2013年03期

9 焦瑞蓮,薛彥棠;施用農藥對果園環(huán)境的污染及其治理[J];河北果樹;2004年05期

10 趙慧芹;張玉星;郭麗娟;方廣天;;農藥殘留現(xiàn)狀、危害性及其研究進展[J];河北林果研究;2007年03期

  本文關鍵詞：擬除蟲菊酯噬菌體抗體庫構建及基因工程抗體制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：314248