本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲(chóng)Vasa樣蛋白基因的獲得、表達(dá)及初步鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：在獲得日本血吸蟲(chóng)Vasa樣蛋白基因的cDNA全長(zhǎng)序列后,選取含有DEAD-BOX家族高度保守的一段基因序列進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化和蟲(chóng)體免疫定位,同時(shí)研究Vasa在日本血吸蟲(chóng)生活史的各個(gè)階段mRNA和蛋白的表達(dá)情況,從而為進(jìn)一步研究Vasa基因在日本血吸蟲(chóng)生殖生物學(xué)方面的功能和作用奠定基礎(chǔ)。 方法：以日本血吸蟲(chóng)cDNA為模板,擴(kuò)增獲得日本血吸蟲(chóng)Vasa樣基因全長(zhǎng)序列。將其全長(zhǎng)序列經(jīng)BLAST軟件分析,利用貝葉斯法建立了日本血吸蟲(chóng)Vasa基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。選擇SjVasa全長(zhǎng)序列中含有DEAD-BOX家族的堿基序列進(jìn)行擴(kuò)增并在體外誘導(dǎo)表達(dá)、純化蛋白。用純化后的蛋白免疫Balb/c、鼠,獲得抗Vasa蛋白的多克隆抗體。用熒光定量PCR和Western-Blot的方法分別檢測(cè)了日本血吸蟲(chóng)Vasa mRNA和蛋白在血吸蟲(chóng)生活史不同時(shí)期(蟲(chóng)卵、尾蚴、12天童蟲(chóng)、18天雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)、24天雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)和36天雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng))的表達(dá)量。用血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)瓊脂石蠟雙包埋法切片,免疫組化實(shí)驗(yàn)方法觀察SjVasa在日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的定位。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增獲得了一個(gè)堿基數(shù)目為2820bp,共編碼936個(gè)氨基酸,理論相對(duì)分子量37kD,等電點(diǎn)為8.75的血吸蟲(chóng)基因。選取DEAD-BOX基因的代表來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),從系統(tǒng)進(jìn)化枝來(lái)看,該日本血吸蟲(chóng)基因與其他物種Vasa基因聚為一支,確定為日本血吸蟲(chóng)Vasa基因,屬于DEAD-BOX家族,并且與曼氏血吸蟲(chóng)的Vasa樣基因亞型(Smvlg3)同源性達(dá)到94%,將其命名為日本血吸蟲(chóng)Vasa并在GenBank注冊(cè)。熒光定量PCR和Western-blot結(jié)果均顯示SjVasa mRNA和蛋白的表達(dá)量在尾蚴期到24天產(chǎn)卵期這段時(shí)間一直持續(xù)增長(zhǎng),18天的SjVasa mRNA和蛋白表達(dá)量相對(duì)于12天童蟲(chóng)的表達(dá)量均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SjVasa mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)量在24天的雌蟲(chóng)最高,具有顯著性差異(P0.05)。瓊脂石蠟雙包埋法切片免疫組化結(jié)果顯示,Vasa蛋白主要分布于雌蟲(chóng)卵黃腺、卵巢末端較為成熟的卵細(xì)胞和代謝旺盛的體壁組織；在雄蟲(chóng)的睪丸細(xì)胞和代謝旺盛的體壁組織也有分布。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增出日本血吸蟲(chóng)Vasa樣蛋白基因的全長(zhǎng)并上傳到Genebank上進(jìn)行注冊(cè),注冊(cè)號(hào)：(AFC17964)；成功表達(dá)和純化原核表達(dá)蛋白并制備了該蛋白的多克隆抗體；通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析顯示,該基因在日本血吸蟲(chóng)的各期雌雄蟲(chóng)體均有表達(dá),尾蚴期到24天產(chǎn)卵期這段時(shí)間一直持續(xù)增長(zhǎng),其中在24天的雌蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)量最高,雌蟲(chóng)表達(dá)量略高于雄蟲(chóng)。用Western-blot方法在蛋白水平上進(jìn)行了分析,結(jié)果和熒光定量PCR基本一致。免疫組化結(jié)果顯示Vasa蛋白在雌蟲(chóng)主要分布于卵黃腺和代謝旺盛的體壁組織以及在卵巢末端的較為成熟的卵細(xì)胞；在雄蟲(chóng)睪丸部分細(xì)胞和代謝旺盛的體表組織也有分布。SjVasa蛋白在血吸蟲(chóng)雌雄蟲(chóng)體內(nèi)均有表達(dá)且主要分布在生殖細(xì)胞以及代謝旺盛的細(xì)胞中,提示SjVasa蛋白可能在日本血吸蟲(chóng)細(xì)胞分化和增殖發(fā)育中具有一定的調(diào)控作用,其確切的功能有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲(chóng) Vasa樣基因 蛋白定位
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R383.2;R3416
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-10
• 1 前言10-12
• 2 材料與方法12-33
• 2.1 材料12-17
• 2.1.1 主要軟件12
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒12
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12
• 2.1.4 主要試劑12
• 2.1.5 部分試劑的配置方法12-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-33
• 2.2.1 日本血吸蟲(chóng)Vasa樣蛋白全長(zhǎng)基因擴(kuò)增17-18
• 2.2.2 日本血吸蟲(chóng)Vasa基因的生物信息學(xué)分析18-19
• 2.2.3 pET28a(+)-SjVasa重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定19-21
• 2.2.4 pET28a(+)-SjVasa蛋白的表達(dá)及SDS-PAGE分析21-23
• 2.2.5 pET28a(+)-SjVasa蛋白的變性、純化及復(fù)性23-25
• 2.2.6 抗SjVasa蛋白多克隆抗體制備25-26
• 2.2.7 SjVasa蛋白多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)26
• 2.2.8 熒光定量PCR檢測(cè)SjVasa基因在不同時(shí)期血吸蟲(chóng)的表達(dá)26-29
• 2.2.9. Western-blot檢測(cè)SjVasa蛋白在蟲(chóng)卵及各期蟲(chóng)體的表達(dá)29-31
• 2.2.10 免疫組化檢測(cè)SjVasa蛋白在蟲(chóng)體的定位31-33
• 3 結(jié)果33-41
• 3.1 SjVasa基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增33
• 3.2 SjVasa基因的生物信息學(xué)分析33-35
• 3.3 SjVasa DEAD-BOX編碼基因的擴(kuò)增35-36
• 3.4 SjVasa基因的蛋白表達(dá)和純化36-37
• 3.5 SjVasa多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)結(jié)果37-38
• 3.6 SjVasa基因在不同時(shí)期血吸蟲(chóng)的表達(dá)38
• 3.7 SjVasa蛋白在不同時(shí)期血吸蟲(chóng)的表達(dá)38-40
• 3.8 SjVasa蛋白在蟲(chóng)體的定位40-41
• 4 討論41-43
• 5 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷49-51
• 致謝51-52
• 綜述52-60
• 參考文獻(xiàn)57-60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 何毅勛,楊惠中;日本血吸蟲(chóng)發(fā)育的生理學(xué)研究[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);1980年01期

2 李石柱;鄭浩;高婧;張利娟;朱蓉;許靜;郭家鋼;肖寧;周曉農(nóng);;2012年全國(guó)血吸蟲(chóng)病疫情通報(bào)[J];中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志;2013年06期

  本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲(chóng)Vasa樣蛋白基因的獲得、表達(dá)及初步鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：314165