發(fā)布時(shí)間：2021-04-15 06:31

　　目的：通過(guò)新構(gòu)建的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（VSV-G／MuLV），介導(dǎo)組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plaminogen activator，tPA）基因，轉(zhuǎn)導(dǎo)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞，探索心肌成纖維細(xì)胞成為tPA基因治療靶細(xì)胞的可能性。 方法： 1、疹型口炎病毒殼G糖蛋白（VSV-G）替代MuLV的enV蛋白，從而產(chǎn)生一種有轉(zhuǎn)染能力的以MuLV為基礎(chǔ)的病毒載體，稱(chēng)為VSV-G假型MuLV載體（VSV-G／MuLV），通過(guò)293T／17細(xì)胞共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCnBgSN、pHIT60（for gal-pol）和pCVG（for VSV-G），采用磷酸鈣共沉淀法產(chǎn)生；VSV-G／MuLV病毒生產(chǎn)細(xì)胞293／GPG的產(chǎn)生；VSV-G／MuLV病毒上清的收集及滴度測(cè)定。 2、采用兩次差速貼壁法（每次持續(xù)60分鐘）分離、培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維纖胞；通過(guò)倒置顯微鏡觀察心肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法（SP法）鑒定心肌成纖維細(xì)胞。 3、制備含tPA基因假型病毒載體VSV-G／tPA，通過(guò)質(zhì)粒pHIT60（for gal-pol）、pCVG（for VSV-G）和... 

【文章來(lái)源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

vsv一G/MuLv病毒滴度測(cè)定討論

無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)(圖1)。2SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果心肌成纖維細(xì)胞波形蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，即細(xì)胞漿內(nèi)圍繞細(xì)胞核呈棕褐色顆粒狀改變，陽(yáng)性率在95%以上(圖2、3);肌動(dòng)蛋白呈陰性反應(yīng)，即細(xì)胞漿內(nèi)圍繞細(xì)胞核呈棕褐色顆粒狀改變數(shù)在碼以下(圖4);PBS對(duì)照呈陰性(圖5)。圖1倒置顯微鏡下心肌成纖維細(xì)胞(x40)

圖6倒置顯微鏡下心肌細(xì)胞(x40)討論1心肌成纖維細(xì)胞與心肌細(xì)胞的分離和純化心臟細(xì)胞包括心肌細(xì)胞和心肌間質(zhì)細(xì)胞，心肌間質(zhì)細(xì)胞中，心肌成纖維細(xì)胞大多數(shù)，研究心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞在心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展、心血管作用機(jī)制及這兩種細(xì)胞之間的相互作用，已越來(lái)越受到人們的關(guān)注。心肌成細(xì)胞與心肌細(xì)胞的分離和純化是心臟生理學(xué)研究中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，大用差速貼壁分離法。經(jīng)典的差速貼壁分離法是:用胰蛋白酶消化心肌組織所混合細(xì)胞懸液，接種在適當(dāng)大小的培養(yǎng)瓶中，37℃靜置如min，輕輕振搖后尚未貼壁的心肌細(xì)胞，重新接種，可得純度大于95%的心肌細(xì)胞，而原培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞幾乎全部為心肌成細(xì)胞，其純度也可達(dá)到大于90%。所取貼壁的各有不同。短到20min‘3’，長(zhǎng)至3h，通常以如min多用。此方法具有操作

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]胰島素促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和心肌細(xì)胞肥大的作用[J]. 洪華山,林嵐,王一波,江瓊,陳建華.  中國(guó)病理生理雜志. 2002(05)
[2]體外培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞增殖的檢測(cè)方法[J]. 林嵐,洪華山,王一波,江瓊.  福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2000(01)
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