本文關鍵詞：人附睪分泌蛋白4（HE4）及癌抗原-125（CA125）雙標記時間分辨熒光免疫分析定量檢測試劑的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的 卵巢癌是最常見的婦科腫瘤之一,其致死率占各類婦科腫瘤的首位。國際癌癥研究機構的數(shù)據(jù)顯示,估計2008年的新發(fā)病率為6.3/10萬,死亡率為3.8/10萬。我國腫瘤登記地區(qū)資料表明,2009年我國卵巢癌的新發(fā)病率為7.95/10萬,死亡率為3.44/10萬。由于卵巢癌的早期癥狀很不明顯,診斷延誤導致確診時約70%的卵巢癌已屬晚期。卵巢癌早期預后極好,但晚期只有10-30%的存活率。因此,迫切需要一些敏感性好、特異性高的腫瘤標志物用于卵巢癌的早期診斷。 目前卵巢癌常規(guī)診斷主要是檢測生物標志物癌抗原-125(CA125)。CA125是從非黏性卵巢癌細胞表面分泌到血液中的一種糖蛋白,分子量200kD,是上皮性卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的標志物。CA125升高還可見于胰腺癌、肺癌及其他婦科腫瘤,是一種廣譜的腫瘤標記物。雖然80%以上的上皮性卵巢癌CA125在血清濃度會升高,但對于早期卵巢癌的診斷敏感性、特異性比較低。因此,CA125不能作為診斷卵巢癌的唯一指標,它需要另一種腫瘤標志物替代它或一起實現(xiàn)聯(lián)合診斷。 人附睪分泌蛋白4(HE4)是一種新的、有潛力的卵巢癌標志物,在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測方面具有良好的應用前景。HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心(WFDC)蛋白家族。其基因定位在染色體20q12—q13.1,全長11.78kb,由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成,編碼小分子蛋白,有高度保守的兩個“乳清酸性蛋白(whey acidic proteins,WAP)域”和一個“4-二硫化中心”,其中的小分子分泌型蛋白與細胞外蛋白酶抑制劑有極高的同源性。HE4基因編碼蛋白的分子量為13KD,而成熟糖化后的HE4蛋白是含有2個WFDC結構域的單肽,分子量約20-25KD。國內(nèi)外學者對HE4研究表明,正常生理情況下,HE4在人體的表達水平非常低,但在卵巢癌組織和患者血清中均高表達。Hellstrom指出,在卵巢癌血清中,HE4與CA125的敏感性相似,但在惡性腫瘤與婦科良性疾病的血清中,HE4的特異性遠高于CA125。而日益增多的研究證據(jù)表明,HE4在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測方面具有良好的應用前景。 此外,有文獻指出,CA125和HE4相結合預測卵巢惡性腫瘤比單指標預測更加準確,當CA125聯(lián)合HE4用于檢測惡性腫瘤,敏感性為76.4%,特異性為95%,大大高于單個指標檢測。 標記免疫分析,是一門將多種標記示蹤技術的高度靈敏性和免疫學抗原抗體反應的高度特異性相結合進行分析測定,集基礎醫(yī)學、實驗技術和臨床應用于一體的學科。標記免疫分析包括放射免疫分析(RIA)及非放射免疫分析,后者包括熒光免疫分析(FIA)、膠體金免疫分析(GICA)、酶免疫分析(EIA)、化學發(fā)光免疫分析(CLIA)、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)等。時間分辨熒光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一種靈敏的高端定量免疫檢測技術,是以鑭系稀土離子作為標記物來標記抗原或抗體,因鑭系稀土離子具有獨特的熒光特性,該技術能夠獲得極高的信噪比,從而具有很高的靈敏度(10-18mol/孔),且具有標記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復性好、標準曲線范圍寬、操作流程短、易自動化、不受樣品自然熒光干擾、多標記和應用范圍十分廣泛等優(yōu)點。時間分辨熒光免疫分析相對于酶免分析、放射免疫分析有更高的臨床應用價值。TRFIA技術適用于各種抗原抗體的臨床檢測,在市場上已得到廣泛應用。 本研究采用時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術研制HE4定量檢測試劑、HE4與CA125雙標記定量檢測試劑,通過檢測各項性能指標,并與其它檢測試劑盒進行比較,評價其在臨床檢測應用中的可行性。 方法： (一)采用雙抗體夾心法研制血清人附睪分泌蛋白-4(HE4)時間分辨免疫熒光分析檢測試劑。 1.用HE4抗原配制定標品及質(zhì)控品定標品濃度：20pmol/L、200pmol/L、500pmol/L、1000pmol/L;質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ濃度分別為：30pmol/L、90pmol/L和270pmol/L。每瓶1ml分裝凍干,4℃保存?zhèn)溆谩?2.用包被液將HE4包被抗體稀釋至3ug/ml,加入96微孔板中包被,37℃震蕩2小時后,4℃過夜,37℃封閉3小時,真空抽干,4℃保存。 3.Eu3+標記抗體制備超濾管純化抗體后,按質(zhì)量比5：1與銪標記試劑充分混勻,25℃振蕩過夜,次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化,同時收集流出液(1ml/管),逐管測熒光值,合并峰管,加入10%濃度的BSA作保護劑,—20℃保存。 4.原料篩選不同抗體進行配對篩選評估,選擇陽性熒光值較高、陰性本底較低、線性好、靈敏度高、特異性高、信噪比高、臨床血樣測值準確的一對為HE4試劑原料。 5.采用棋盤滴定法對6F8包被抗體的包被濃度及H5的銪標記抗體的最佳稀釋度進行確定。選擇陽性熒光值較高、陰性本底較低,信噪比高的為最佳包被量及稀釋度。 6.參考值范圍：以自制的HE4-TRFIA試劑檢測451份女性健康人血清,統(tǒng)計血清HE4抗原水平的分布情況,計算樣本熒光值與陰性對照的比值。取比值的平均值,以比值均值加兩個標準差,初步確定為試劑盒的正常人參考值,再綜合其他文獻研究資料及臨床現(xiàn)行參考值范圍,最終確定參考值范圍。 7.試劑性能指標的評價 7.1繪制劑量-反應曲線：以自配的參考標準品濃度的對數(shù)為自變量(X),以信號值1×103計數(shù)的對數(shù)為因變量(Y),用雙對數(shù)數(shù)學模型Log-Log函數(shù)處理。 7.2線性范圍及分析靈敏度：重復測定零定標品(A)10次,計算其均值(X)及標準差(SD)。以X+2SD所得信號值代入劑量-反應曲線求出濃度值,為該試劑盒的最低檢出量,即分析靈敏度。 7.3Hook效應：配制濃度遞增的多個參考標準品抗原,并對其進行測定。 7.4準確度實驗：使用陰性血清將HE4抗原系列倍比稀釋作為樣品,在自制試劑盒上測定,各設3個復孔,計算不同稀釋度條件下理論濃度及實測濃度的比值,即稀釋回收率。 7.5精密度實驗：重復測定質(zhì)控品Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ,得到各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標準差及變異系數(shù)(CV)。 7.6特異性實驗：將一定濃度的干擾物質(zhì)用本試劑盒檢測,得到的相應濃度與該類物質(zhì)的量的比值的百分率,為交叉反應率。 7.7抗干擾性分析：質(zhì)控Ⅰ、Ⅲ中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和膽紅素,并對其進行測定,判斷干擾情況。 7.8穩(wěn)定性：37℃放置7天,評價其線性、精密性等指標。 8.與國外試劑的比較實驗：樣本用自制試劑與對照試劑檢測后,將所測濃度值進行相關性分析。 (二)采用雙抗體夾心法研制人附睪蛋白4(HE4)及癌抗原-125(CA125)雙標記定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑。 1.用HE4抗原、CA125抗原配制定標品及質(zhì)控品,定標品濃度：Opmol/L/OU/mL、20pmol/L/28.4U/mL、50pmol/L/53U/mL、200pmol/L/500pmol/L/445.9U/mL、1000pmol/L/815U/mL,質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ濃度為：35pmol/L/16U/mL、110pmol/L/41U/mL和350pmol/L/265U/mL每瓶1ml分裝凍干,4℃保存?zhèn)溆谩?2.固相包被抗體用包被液將HE4包被抗體6F8、CA125包被抗體M5807稀釋后,一同加入96微孔板中包被,37℃震蕩2小時后,4℃過夜,37℃封閉3小時,真空抽干,4℃保存。 3.Eu3十標記抗體制備超濾管純化抗體后,按質(zhì)量比5：1與銪標記試劑充分混勻,25℃振蕩過夜,次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化,同時收集流出液(1ml/管),逐管測量吸光度,合并峰管,加10%BSA保護劑,—20℃保存。 4.Sm3+標記抗體制備超濾管純化抗體后,按質(zhì)量比2：1與銪標記試劑充分混勻,25℃振蕩過夜,次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化,同時收集流出液(1ml/管),逐管測量吸光度,合并峰管,加入10%濃度的BSA作保護劑,—20℃保存。 5.比較HE4及CA125不同標記的熒光值及臨床血樣測值,確定反應條件。 6.采用棋盤滴定法對M5807包被抗體的包被濃度及M5814的銪標記抗體的最佳稀釋度進行確定。選擇陽性熒光值較高、陰性本底較低,信噪比高的為最佳包被量及稀釋度。 7.對加樣體積(25μL、30μL、35μL、40μL、50μL)進行優(yōu)化。 8.試劑性能指標的評價 8.1繪制劑量-反應曲線：以自配的參考標準品濃度的對數(shù)為自變量(X),以信號值1×103計數(shù)的對數(shù)為因變量(Y),用雙對數(shù)數(shù)學模型Log-Log函數(shù)處理,分別繪制HE4-TRFIA和CA125-TRFIA劑量-反應曲線。 8.2線性范圍、分析靈敏度及Hook效應：重復測定零定標品(A)20次,分別計算HE4和CA125的均值(X)及標準差(SD)。以均值X+2SD所得信號值代入劑量-反應曲線求出濃度值,計算出HE4-TRFIA和CA125-TRFIA的分析靈敏度。測定多個濃度遞增的參考標準品。 8.3準確度實驗：使用陰性血清將HE4抗原和CA125抗原同時倍比稀釋作為樣品,在自制試劑盒上測定,各設3個復孔,計算不同稀釋度條件下理論濃度及實測濃度的比值,即稀釋回收率。 8.4精密度實驗：重復測定質(zhì)控品Ⅰ,Ⅱ、Ⅲ,得到各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標準差及變異系數(shù)(CV)。 8.5特異性實驗：用HE4/CA125-TRFIA試劑盒測定一定濃度的干擾物質(zhì),計算得到的相應濃度與該類物質(zhì)的量的比值的百分率,為交叉反應率。 8.6抗干擾性分析：質(zhì)控Ⅰ、Ⅲ中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和膽紅素,并對其進行測定,判斷干擾情況。 8.7穩(wěn)定性：37℃放置7天,檢測試劑盒各項性能指標。 9.與國外試劑的比較實驗：樣本用自制試劑與對照試劑檢測后將所測濃度值進行相關性分析。 結果： (一)采用雙抗體夾心法研制人附睪蛋白4(HE4)定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑。 抗體配對篩選確定6F8為包被抗體及H5為標記抗體,棋盤滴定法確定6F8按3ug/ml包被、H5-Eu3+的稀釋比例為1：200。451份相對健康女性血清測試結果,t檢驗結果表明50歲以上的HE4水平顯著高于50歲以下；當濃度值在≤90pmol/L時,包含了96.9%的樣本；ROC曲線表明,當濃度值在90pmol/L時,敏感性為75%,特異性為96.1%；據(jù)此設定本試劑盒檢測時的人血清HE4濃度的cut-off值為90pmol/L。計算得出試劑盒的最低檢出量為0.73pmol/L,測量范圍為0.73-1000pmol/L,線性范圍內(nèi),劑量-反應曲線線性相關系數(shù),r=0.9996,當濃度值大于2000pmol/L時,所測熒光值線性出現(xiàn)偏差,曲線出現(xiàn)HOOK效應。本試劑稀釋回收率在90%-113%之間。分析內(nèi)和分析間的精密度分別為4.6%-7.5%和8.3%-14.4%。與CA153、CEA、AFP、HBsAg、CA125、CA19-9、 CA50和HCG無交叉反應。本試劑不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天,各項性能指標均符合要求,穩(wěn)定性較好。將本試劑與羅氏試劑做相關分析,分別對133例血清樣本進行檢測,評價兩種試劑之間的檢測相關性,相關性方程為y=0.794x+12.255,R2為0.976,P0.001,說明本試劑能夠很好的滿足臨床檢測的要求。. (二)采用雙抗體夾心法研制人附睪蛋白4(HE4)和癌抗原-125(CA125)雙標記定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑。 根據(jù)熒光值計數(shù)及臨床血樣測值,確定HE4標記抗體H5用Eu3+標記,CA125標記抗體M5814用Sm3+標記,棋盤滴定法確定CA125包被抗體M5807按3ug/ml包被、M5814-Sm3+的稀釋比例為1：50。 HE4試劑最低檢出量為0.476pmol/L,測量范圍為0.476-1000pmol/L;線性范圍內(nèi),HE4劑量-反應曲線線性相關系數(shù),r=0.9994；稀釋回收率在93.5%-107.3%之間。HE4試劑分析內(nèi)和分析間的精密度分別為3.02%-8.81%和0.65%-8.57%。HE4試劑與CA153、AFP、CEA、HBsAg、CA19-9、CA50、hCG無交叉反應。HE4試劑不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天,各項性能指標均符合要求,穩(wěn)定性較好。將本試劑與羅氏試劑做相關分析,對147例血清樣本進行檢測,評價兩種試劑之間HE4的檢測相關性,相關性方程為y=0.9756x-0.1956,R2為0.905,P0.001,說明本試劑能夠很好的滿足臨床檢測的要求。 CA125試劑最低檢出量為1.6U/mL,測量范圍為1.6-815U/mL；線性范圍內(nèi),CA125劑量-反應曲線線性相關系數(shù),r=1.0000；稀釋回收率在97.9%-105%之間。CA125試劑分析內(nèi)和分析間的精密度分別為2.60%-9.27%和5.24%-7.88%。CA125試劑與CA153、AFP、CEA、HBsAg、CA19-9、CA50、 hCG無交叉反應。CA125試劑不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天,各項性能指標均符合要求,穩(wěn)定性較好。將本試劑與羅氏試劑做相關分析,對153例血清樣本進行檢測,評價兩種試劑之間CA125的檢測相關性,相關性方程為y=0.9953x-10.070,R2為0.986,P0.001,說明本試劑能夠很好的滿足臨床檢測的要求。 結論： 上述結果表明本研究研制的人附睪蛋白4(HE4)定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑、HE4和CA125雙標記時間分辨熒光免疫分析定量檢測試劑的各項指標(準確度、靈敏度、精密度、特異性等)均滿足體外診斷試劑的注冊要求,與進口產(chǎn)品性能相近,有望經(jīng)進一步優(yōu)化后應用于生產(chǎn)。
【關鍵詞】：時間分辨熒光免疫分析 人附睪分泌蛋白4 癌抗原-125 檢測
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-33
• 第一章 血清人附睪分泌蛋白-4(HE4)時間分辨免疫熒光分析檢測試劑的研制33-55
• 1.1 材料33-35
• 1.2 方法35-41
• 1.3 結果41-52
• 1.4 討論52-54
• 1.5 結論54-55
• 第二章 人附睪分泌蛋白4(HE4)及癌抗原-125(CA125)雙標記定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑55-77
• 2.1 材料55-57
• 2.2 方法57-62
• 2.3 結果62-75
• 2.4 討論75-76
• 2.5 結論76-77
• 參考文獻77-81
• 中英文縮略詞81-83
• 碩士期間論文發(fā)表情況83-84
• 致謝84-85

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：人附睪分泌蛋白4（HE4）及癌抗原-125（CA125）雙標記時間分辨熒光免疫分析定量檢測試劑的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：313039