本文關(guān)鍵詞：人附睪分泌蛋白4（HE4）及癌抗原-125（CA125）雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析定量檢測試劑的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的 卵巢癌是最常見的婦科腫瘤之一,其致死率占各類婦科腫瘤的首位。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)顯示,估計2008年的新發(fā)病率為6.3/10萬,死亡率為3.8/10萬。我國腫瘤登記地區(qū)資料表明,2009年我國卵巢癌的新發(fā)病率為7.95/10萬,死亡率為3.44/10萬。由于卵巢癌的早期癥狀很不明顯,診斷延誤導(dǎo)致確診時約70%的卵巢癌已屬晚期。卵巢癌早期預(yù)后極好,但晚期只有10-30%的存活率。因此,迫切需要一些敏感性好、特異性高的腫瘤標(biāo)志物用于卵巢癌的早期診斷。 目前卵巢癌常規(guī)診斷主要是檢測生物標(biāo)志物癌抗原-125(CA125)。CA125是從非黏性卵巢癌細(xì)胞表面分泌到血液中的一種糖蛋白,分子量200kD,是上皮性卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)志物。CA125升高還可見于胰腺癌、肺癌及其他婦科腫瘤,是一種廣譜的腫瘤標(biāo)記物。雖然80%以上的上皮性卵巢癌CA125在血清濃度會升高,但對于早期卵巢癌的診斷敏感性、特異性比較低。因此,CA125不能作為診斷卵巢癌的唯一指標(biāo),它需要另一種腫瘤標(biāo)志物替代它或一起實現(xiàn)聯(lián)合診斷。 人附睪分泌蛋白4(HE4)是一種新的、有潛力的卵巢癌標(biāo)志物,在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測方面具有良好的應(yīng)用前景。HE4屬于乳清酸性4-二硫化中心(WFDC)蛋白家族。其基因定位在染色體20q12—q13.1,全長11.78kb,由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成,編碼小分子蛋白,有高度保守的兩個“乳清酸性蛋白(whey acidic proteins,WAP)域”和一個“4-二硫化中心”,其中的小分子分泌型蛋白與細(xì)胞外蛋白酶抑制劑有極高的同源性。HE4基因編碼蛋白的分子量為13KD,而成熟糖化后的HE4蛋白是含有2個WFDC結(jié)構(gòu)域的單肽,分子量約20-25KD。國內(nèi)外學(xué)者對HE4研究表明,正常生理情況下,HE4在人體的表達(dá)水平非常低,但在卵巢癌組織和患者血清中均高表達(dá)。Hellstrom指出,在卵巢癌血清中,HE4與CA125的敏感性相似,但在惡性腫瘤與婦科良性疾病的血清中,HE4的特異性遠(yuǎn)高于CA125。而日益增多的研究證據(jù)表明,HE4在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測方面具有良好的應(yīng)用前景。 此外,有文獻(xiàn)指出,CA125和HE4相結(jié)合預(yù)測卵巢惡性腫瘤比單指標(biāo)預(yù)測更加準(zhǔn)確,當(dāng)CA125聯(lián)合HE4用于檢測惡性腫瘤,敏感性為76.4%,特異性為95%,大大高于單個指標(biāo)檢測。 標(biāo)記免疫分析,是一門將多種標(biāo)記示蹤技術(shù)的高度靈敏性和免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性相結(jié)合進(jìn)行分析測定,集基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、實驗技術(shù)和臨床應(yīng)用于一體的學(xué)科。標(biāo)記免疫分析包括放射免疫分析(RIA)及非放射免疫分析,后者包括熒光免疫分析(FIA)、膠體金免疫分析(GICA)、酶免疫分析(EIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)等。時間分辨熒光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一種靈敏的高端定量免疫檢測技術(shù),是以鑭系稀土離子作為標(biāo)記物來標(biāo)記抗原或抗體,因鑭系稀土離子具有獨特的熒光特性,該技術(shù)能夠獲得極高的信噪比,從而具有很高的靈敏度(10-18mol/孔),且具有標(biāo)記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復(fù)性好、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、操作流程短、易自動化、不受樣品自然熒光干擾、多標(biāo)記和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點。時間分辨熒光免疫分析相對于酶免分析、放射免疫分析有更高的臨床應(yīng)用價值。TRFIA技術(shù)適用于各種抗原抗體的臨床檢測,在市場上已得到廣泛應(yīng)用。 本研究采用時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術(shù)研制HE4定量檢測試劑、HE4與CA125雙標(biāo)記定量檢測試劑,通過檢測各項性能指標(biāo),并與其它檢測試劑盒進(jìn)行比較,評價其在臨床檢測應(yīng)用中的可行性。 方法： (一)采用雙抗體夾心法研制血清人附睪分泌蛋白-4(HE4)時間分辨免疫熒光分析檢測試劑。 1.用HE4抗原配制定標(biāo)品及質(zhì)控品定標(biāo)品濃度：20pmol/L、200pmol/L、500pmol/L、1000pmol/L;質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ濃度分別為：30pmol/L、90pmol/L和270pmol/L。每瓶1ml分裝凍干,4℃保存?zhèn)溆谩?2.用包被液將HE4包被抗體稀釋至3ug/ml,加入96微孔板中包被,37℃震蕩2小時后,4℃過夜,37℃封閉3小時,真空抽干,4℃保存。 3.Eu3+標(biāo)記抗體制備超濾管純化抗體后,按質(zhì)量比5：1與銪標(biāo)記試劑充分混勻,25℃振蕩過夜,次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化,同時收集流出液(1ml/管),逐管測熒光值,合并峰管,加入10%濃度的BSA作保護(hù)劑,—20℃保存。 4.原料篩選不同抗體進(jìn)行配對篩選評估,選擇陽性熒光值較高、陰性本底較低、線性好、靈敏度高、特異性高、信噪比高、臨床血樣測值準(zhǔn)確的一對為HE4試劑原料。 5.采用棋盤滴定法對6F8包被抗體的包被濃度及H5的銪標(biāo)記抗體的最佳稀釋度進(jìn)行確定。選擇陽性熒光值較高、陰性本底較低,信噪比高的為最佳包被量及稀釋度。 6.參考值范圍：以自制的HE4-TRFIA試劑檢測451份女性健康人血清,統(tǒng)計血清HE4抗原水平的分布情況,計算樣本熒光值與陰性對照的比值。取比值的平均值,以比值均值加兩個標(biāo)準(zhǔn)差,初步確定為試劑盒的正常人參考值,再綜合其他文獻(xiàn)研究資料及臨床現(xiàn)行參考值范圍,最終確定參考值范圍。 7.試劑性能指標(biāo)的評價 7.1繪制劑量-反應(yīng)曲線：以自配的參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為自變量(X),以信號值1×103計數(shù)的對數(shù)為因變量(Y),用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理。 7.2線性范圍及分析靈敏度：重復(fù)測定零定標(biāo)品(A)10次,計算其均值(X)及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。以X+2SD所得信號值代入劑量-反應(yīng)曲線求出濃度值,為該試劑盒的最低檢出量,即分析靈敏度。 7.3Hook效應(yīng)：配制濃度遞增的多個參考標(biāo)準(zhǔn)品抗原,并對其進(jìn)行測定。 7.4準(zhǔn)確度實驗：使用陰性血清將HE4抗原系列倍比稀釋作為樣品,在自制試劑盒上測定,各設(shè)3個復(fù)孔,計算不同稀釋度條件下理論濃度及實測濃度的比值,即稀釋回收率。 7.5精密度實驗：重復(fù)測定質(zhì)控品Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ,得到各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV)。 7.6特異性實驗：將一定濃度的干擾物質(zhì)用本試劑盒檢測,得到的相應(yīng)濃度與該類物質(zhì)的量的比值的百分率,為交叉反應(yīng)率。 7.7抗干擾性分析：質(zhì)控Ⅰ、Ⅲ中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和膽紅素,并對其進(jìn)行測定,判斷干擾情況。 7.8穩(wěn)定性：37℃放置7天,評價其線性、精密性等指標(biāo)。 8.與國外試劑的比較實驗：樣本用自制試劑與對照試劑檢測后,將所測濃度值進(jìn)行相關(guān)性分析。 (二)采用雙抗體夾心法研制人附睪蛋白4(HE4)及癌抗原-125(CA125)雙標(biāo)記定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑。 1.用HE4抗原、CA125抗原配制定標(biāo)品及質(zhì)控品,定標(biāo)品濃度：Opmol/L/OU/mL、20pmol/L/28.4U/mL、50pmol/L/53U/mL、200pmol/L/500pmol/L/445.9U/mL、1000pmol/L/815U/mL,質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ濃度為：35pmol/L/16U/mL、110pmol/L/41U/mL和350pmol/L/265U/mL每瓶1ml分裝凍干,4℃保存?zhèn)溆谩?2.固相包被抗體用包被液將HE4包被抗體6F8、CA125包被抗體M5807稀釋后,一同加入96微孔板中包被,37℃震蕩2小時后,4℃過夜,37℃封閉3小時,真空抽干,4℃保存。 3.Eu3十標(biāo)記抗體制備超濾管純化抗體后,按質(zhì)量比5：1與銪標(biāo)記試劑充分混勻,25℃振蕩過夜,次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化,同時收集流出液(1ml/管),逐管測量吸光度,合并峰管,加10%BSA保護(hù)劑,—20℃保存。 4.Sm3+標(biāo)記抗體制備超濾管純化抗體后,按質(zhì)量比2：1與銪標(biāo)記試劑充分混勻,25℃振蕩過夜,次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化,同時收集流出液(1ml/管),逐管測量吸光度,合并峰管,加入10%濃度的BSA作保護(hù)劑,—20℃保存。 5.比較HE4及CA125不同標(biāo)記的熒光值及臨床血樣測值,確定反應(yīng)條件。 6.采用棋盤滴定法對M5807包被抗體的包被濃度及M5814的銪標(biāo)記抗體的最佳稀釋度進(jìn)行確定。選擇陽性熒光值較高、陰性本底較低,信噪比高的為最佳包被量及稀釋度。 7.對加樣體積(25μL、30μL、35μL、40μL、50μL)進(jìn)行優(yōu)化。 8.試劑性能指標(biāo)的評價 8.1繪制劑量-反應(yīng)曲線：以自配的參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為自變量(X),以信號值1×103計數(shù)的對數(shù)為因變量(Y),用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理,分別繪制HE4-TRFIA和CA125-TRFIA劑量-反應(yīng)曲線。 8.2線性范圍、分析靈敏度及Hook效應(yīng)：重復(fù)測定零定標(biāo)品(A)20次,分別計算HE4和CA125的均值(X)及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。以均值X+2SD所得信號值代入劑量-反應(yīng)曲線求出濃度值,計算出HE4-TRFIA和CA125-TRFIA的分析靈敏度。測定多個濃度遞增的參考標(biāo)準(zhǔn)品。 8.3準(zhǔn)確度實驗：使用陰性血清將HE4抗原和CA125抗原同時倍比稀釋作為樣品,在自制試劑盒上測定,各設(shè)3個復(fù)孔,計算不同稀釋度條件下理論濃度及實測濃度的比值,即稀釋回收率。 8.4精密度實驗：重復(fù)測定質(zhì)控品Ⅰ,Ⅱ、Ⅲ,得到各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV)。 8.5特異性實驗：用HE4/CA125-TRFIA試劑盒測定一定濃度的干擾物質(zhì),計算得到的相應(yīng)濃度與該類物質(zhì)的量的比值的百分率,為交叉反應(yīng)率。 8.6抗干擾性分析：質(zhì)控Ⅰ、Ⅲ中加入一定量的甘油三酯、血紅蛋白和膽紅素,并對其進(jìn)行測定,判斷干擾情況。 8.7穩(wěn)定性：37℃放置7天,檢測試劑盒各項性能指標(biāo)。 9.與國外試劑的比較實驗：樣本用自制試劑與對照試劑檢測后將所測濃度值進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果： (一)采用雙抗體夾心法研制人附睪蛋白4(HE4)定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑。 抗體配對篩選確定6F8為包被抗體及H5為標(biāo)記抗體,棋盤滴定法確定6F8按3ug/ml包被、H5-Eu3+的稀釋比例為1：200。451份相對健康女性血清測試結(jié)果,t檢驗結(jié)果表明50歲以上的HE4水平顯著高于50歲以下；當(dāng)濃度值在≤90pmol/L時,包含了96.9%的樣本；ROC曲線表明,當(dāng)濃度值在90pmol/L時,敏感性為75%,特異性為96.1%；據(jù)此設(shè)定本試劑盒檢測時的人血清HE4濃度的cut-off值為90pmol/L。計算得出試劑盒的最低檢出量為0.73pmol/L,測量范圍為0.73-1000pmol/L,線性范圍內(nèi),劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù),r=0.9996,當(dāng)濃度值大于2000pmol/L時,所測熒光值線性出現(xiàn)偏差,曲線出現(xiàn)HOOK效應(yīng)。本試劑稀釋回收率在90%-113%之間。分析內(nèi)和分析間的精密度分別為4.6%-7.5%和8.3%-14.4%。與CA153、CEA、AFP、HBsAg、CA125、CA19-9、 CA50和HCG無交叉反應(yīng)。本試劑不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天,各項性能指標(biāo)均符合要求,穩(wěn)定性較好。將本試劑與羅氏試劑做相關(guān)分析,分別對133例血清樣本進(jìn)行檢測,評價兩種試劑之間的檢測相關(guān)性,相關(guān)性方程為y=0.794x+12.255,R2為0.976,P0.001,說明本試劑能夠很好的滿足臨床檢測的要求。. (二)采用雙抗體夾心法研制人附睪蛋白4(HE4)和癌抗原-125(CA125)雙標(biāo)記定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑。 根據(jù)熒光值計數(shù)及臨床血樣測值,確定HE4標(biāo)記抗體H5用Eu3+標(biāo)記,CA125標(biāo)記抗體M5814用Sm3+標(biāo)記,棋盤滴定法確定CA125包被抗體M5807按3ug/ml包被、M5814-Sm3+的稀釋比例為1：50。 HE4試劑最低檢出量為0.476pmol/L,測量范圍為0.476-1000pmol/L;線性范圍內(nèi),HE4劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù),r=0.9994；稀釋回收率在93.5%-107.3%之間。HE4試劑分析內(nèi)和分析間的精密度分別為3.02%-8.81%和0.65%-8.57%。HE4試劑與CA153、AFP、CEA、HBsAg、CA19-9、CA50、hCG無交叉反應(yīng)。HE4試劑不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天,各項性能指標(biāo)均符合要求,穩(wěn)定性較好。將本試劑與羅氏試劑做相關(guān)分析,對147例血清樣本進(jìn)行檢測,評價兩種試劑之間HE4的檢測相關(guān)性,相關(guān)性方程為y=0.9756x-0.1956,R2為0.905,P0.001,說明本試劑能夠很好的滿足臨床檢測的要求。 CA125試劑最低檢出量為1.6U/mL,測量范圍為1.6-815U/mL；線性范圍內(nèi),CA125劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù),r=1.0000；稀釋回收率在97.9%-105%之間。CA125試劑分析內(nèi)和分析間的精密度分別為2.60%-9.27%和5.24%-7.88%。CA125試劑與CA153、AFP、CEA、HBsAg、CA19-9、CA50、 hCG無交叉反應(yīng)。CA125試劑不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾。試劑盒放置于37℃7天,各項性能指標(biāo)均符合要求,穩(wěn)定性較好。將本試劑與羅氏試劑做相關(guān)分析,對153例血清樣本進(jìn)行檢測,評價兩種試劑之間CA125的檢測相關(guān)性,相關(guān)性方程為y=0.9953x-10.070,R2為0.986,P0.001,說明本試劑能夠很好的滿足臨床檢測的要求。 結(jié)論： 上述結(jié)果表明本研究研制的人附睪蛋白4(HE4)定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑、HE4和CA125雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析定量檢測試劑的各項指標(biāo)(準(zhǔn)確度、靈敏度、精密度、特異性等)均滿足體外診斷試劑的注冊要求,與進(jìn)口產(chǎn)品性能相近,有望經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化后應(yīng)用于生產(chǎn)。
【關(guān)鍵詞】：時間分辨熒光免疫分析 人附睪分泌蛋白4 癌抗原-125 檢測
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-33
• 第一章 血清人附睪分泌蛋白-4(HE4)時間分辨免疫熒光分析檢測試劑的研制33-55
• 1.1 材料33-35
• 1.2 方法35-41
• 1.3 結(jié)果41-52
• 1.4 討論52-54
• 1.5 結(jié)論54-55
• 第二章 人附睪分泌蛋白4(HE4)及癌抗原-125(CA125)雙標(biāo)記定量檢測時間分辨熒光免疫分析試劑55-77
• 2.1 材料55-57
• 2.2 方法57-62
• 2.3 結(jié)果62-75
• 2.4 討論75-76
• 2.5 結(jié)論76-77
• 參考文獻(xiàn)77-81
• 中英文縮略詞81-83
• 碩士期間論文發(fā)表情況83-84
• 致謝84-85

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：人附睪分泌蛋白4（HE4）及癌抗原-125（CA125）雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析定量檢測試劑的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：313039