發(fā)布時(shí)間：2017-04-17 12:15

  本文關(guān)鍵詞：融合蛋白亞單位疫苗對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠和小鼠免疫治療效果的初步評(píng)價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的、主要經(jīng)呼吸道傳播的結(jié)核�。╰uberculosis，TB）是目前世界范圍內(nèi)造成死亡人數(shù)最多的傳染病�？ń槊纾˙acillus Calmette Guerin，BCG）的接種雖然能夠有效預(yù)防兒童TB的發(fā)生，但是無法防止成人的TB感染和潛伏感染的復(fù)發(fā)。由于對(duì)疫苗作用機(jī)制和MTB致病機(jī)制研究緩慢，使得研發(fā)比BCG更為安全有效的預(yù)防疫苗極其困難。TB化療中使用的異煙肼（Isoniazid acid hydrazide，INH）、利福平（Rifampicin，RFP）等藥物主要針對(duì)生長活躍的MTB，對(duì)生長緩慢、代謝遲緩的MTB休眠菌的殺傷效果不明顯，而且化療存在治療周期長、毒副作用大、患者依從性較差等問題，加之TB耐藥形式的日益嚴(yán)峻，因此迫切需要研發(fā)新型的抗TB藥物和療法。治療性疫苗的接種可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗MTB免疫應(yīng)答，有助于提高免疫系統(tǒng)對(duì)持留菌的識(shí)別和清除，從而縮短療程，是目前TB研究的重要方向之一。 目的 建立MTB感染豚鼠模型，在此模型中評(píng)價(jià)融合蛋白Ag85B-ESAT-6＋Hsp65-hIL-2組合MPLA佐劑的亞單位疫苗單獨(dú)和聯(lián)合化療藥物的治療效果及抑制MTB感染復(fù)發(fā)的能力；建立MTB感染小鼠模型，在此模型中評(píng)價(jià)上述亞單位疫苗的單獨(dú)治療和聯(lián)合化療藥物治療的效果。 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果 一、融合蛋白Ag85B-ESAT-6的免疫學(xué)特性研究 方法：使用原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2，Ni2+離子親和層析法純化目的蛋白。以不同劑量（20μg、50μg、100μg、200μg、600μg）Ag85B-ESAT-6重組蛋白分別與50μg單磷酰脂質(zhì)A（MPLA）佐劑混合后皮下多點(diǎn)注射方式免疫豚鼠，共免疫3次，每次間隔3周。每次免疫后2周取血分離血清，ELISA法檢測免疫豚鼠血清特異性IgG抗體及IgG1和IgG2亞類滴度；末次免疫后 2周處死豚鼠，分離外周血白細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞比例。 結(jié)果：純化獲得了純化的重組融合蛋白Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2；以20μgAg85B-ESAT-6免疫2次即可誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生較高水平的IgG抗體；3次免疫后，豚鼠外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞比例均有所下降。 二、融合蛋白亞單位疫苗對(duì)MTB感染豚鼠免疫治療效果的評(píng)價(jià) 方法：以105CFU MTB H37Rv經(jīng)腹股溝皮下注射感染豚鼠，6周后平板計(jì)數(shù)法檢測感染豚鼠肺臟和脾臟荷菌量，確立模型建立。之后將感染豚鼠分為感染未治療組、免疫治療組、化療組、化療聯(lián)合免疫治療組；另設(shè)未感染豚鼠正常對(duì)照組�；熥愿腥竞蟮�6周開始，采用INH和RFP聯(lián)用飲水治療，飲水中藥物濃度為108.5mg/LINH、105mg/L RFP，每周飲用5天，連續(xù)治療11周；免疫治療采用背部皮下接種，間隔一天給予10μgAg85B-ESAT-6＋10μg Hsp65-hIL-2＋5μg MPLA免疫兩次，3周后以同樣方法和劑量給予第二次免疫；全部治療結(jié)束后（即感染第17周）給予各組豚鼠腹腔注射地塞米松1mg/只，每周3次，持續(xù)4周，以此進(jìn)行免疫抑制誘導(dǎo)感染復(fù)發(fā)。實(shí)驗(yàn)過程中每周記錄豚鼠體重；分次采血并檢測血清特異性IgG抗體及IgG1和IgG2亞類水平；HE染色觀察肺組織病理變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血和脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞比例，總T和B細(xì)胞亞群比例；免疫治療完成后4周（感染后17周）和免疫抑制完成后4周（感染后25周）處死豚鼠，平板計(jì)數(shù)法檢測肺臟和脾臟荷菌量。 結(jié)果：感染6周時(shí)豚鼠肺臟和脾臟出現(xiàn)肉眼可見的結(jié)核結(jié)節(jié)，荷菌量分別為5.82±0.29lgCFU和6.53±0.33lgCFU，表明豚鼠感染模型建立成功。感染10周后，未治療組豚鼠體重停止增長，免疫治療組豚鼠在免疫抑制后體重下降明顯，至感染20周全部死亡；免疫治療組和化療聯(lián)合免疫治療組豚鼠血清中抗MTB特異性IgG水平顯著高于感染未治療組（P0.001，P0.001），且MTB特異性抗體的升高是以IgG2亞類為主；感染未治療組豚鼠肺組織呈現(xiàn)嚴(yán)重炎癥病變，而藥物治療組和化療聯(lián)合免疫治療組的豚鼠病理改變較輕；與感染未治療組相比，免疫治療和化療聯(lián)合免疫治療組豚鼠外周血和脾臟T細(xì)胞水平呈上升趨勢，其中CD8+T細(xì)胞比例上升較明顯；治療結(jié)束后，免疫治療組、化療組和化療聯(lián)合免疫治療組肺臟荷菌量均顯著低于感染未治療組（P0.05，P0.05，P0.01），化療組和化療聯(lián)合免疫治療組豚鼠脾臟荷菌量顯著低于感染未治療組（P0.01，P0.01），，免疫抑制后，化療聯(lián)合免疫治療組豚鼠肺臟荷菌量顯著低于化療組（P0.05）。 三、融合蛋白亞單位疫苗對(duì)MTB感染小鼠免疫治療效果的評(píng)價(jià) 方法：以105CFU MTB H37Rv尾靜脈注射感染C57BL/6J小鼠，4周后平板計(jì)數(shù)法檢測感染小鼠肺臟和脾臟荷菌量，確立模型建立。之后將小鼠分為感染未治療組、免疫治療組、半程化療組、半程化療聯(lián)合免疫治療組、全程化療組、全程化療聯(lián)合免疫治療組；另設(shè)未感染小鼠正常對(duì)照組�；熥愿腥竞�4周開始，采用INH和RFP聯(lián)用飲水治療（方法和劑量同上述豚鼠治療實(shí)驗(yàn)），其中半程藥物治療時(shí)間持續(xù)4周，全程藥物治療持續(xù)11周；免疫治療采用背部皮下接種5μg Ag85B-ESAT-6＋5μgHsp65-hIL-2＋5μg MPLA，在感染后第8周進(jìn)行第一次免疫，3周后（感染后第11周）給予第二次免疫。治療結(jié)束后處死豚鼠分離脾淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測MTB抗原刺激后表達(dá)IFN-γ、IL-2、IL-4和TNF-α四種細(xì)胞因子的CD4+和CD8+T脾淋巴細(xì)胞的比例；平板計(jì)數(shù)法檢測小鼠肺臟和脾臟荷菌量。 結(jié)果：感染4周時(shí)小鼠肺臟和脾臟荷菌量分別為3.67±0.10lgCFU和3.54±0.14lgCFU，表明小鼠感染模型建立成功。與正常對(duì)照組小鼠相比，感染未治療組和免疫治療組小鼠脾淋巴細(xì)胞在MTB抗原刺激培養(yǎng)后表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞比例顯著升高（P0.001，P0.001）；感染未治療組和免疫治療組表達(dá)IL-2的CD4+T細(xì)胞比例顯著高于正常對(duì)照組（P0.01，P0.01），半程化療聯(lián)合免疫治療組以及全程化療聯(lián)合免疫治療組該比例分別顯著高于相應(yīng)的半程化療組和全程化療組（P0.001，P0.001）；各感染組表達(dá)IL-4的CD4+T細(xì)胞比例總體呈下降趨勢；全程化療聯(lián)合免疫治療組表達(dá)TNF-α的CD4+T細(xì)胞比例顯著低于全程化療組（P0.001）。各組間表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞比例無顯著差異，感染未治療組和免疫治療組表達(dá)IL-2的CD8+T細(xì)胞比例顯著升高（P0.001，P0.001）；半程化療聯(lián)合免疫治療組和全程化療聯(lián)合免疫治療組該比例分別顯著高于半程化療組和全程化療組（P0.001，P0.01）；感染未治療組和免疫治療組表達(dá)IL-4的CD8+T細(xì)胞比例均顯著上升，半程化療聯(lián)合免疫治療組該比例高于半程化療組（P0.05）；半程化療組和半程化療聯(lián)合免疫治療組停止化療后體內(nèi)荷菌量出現(xiàn)回升但相對(duì)緩慢，與感染未治療組和化療組相比，相應(yīng)的免疫治療組和化療聯(lián)用免疫治療組小鼠臟器荷菌量均無顯著差異。 結(jié)論 Ag85B-ESAT-6和Hsp65-hIL-2組合MPLA佐劑的亞單位疫苗可有效刺激感染豚鼠產(chǎn)生抗MTB的特異性抗體，提高豚鼠外周血和脾臟T細(xì)胞比例，顯著降低感染豚鼠肺臟荷菌量，并且與化療聯(lián)合應(yīng)用后可有效抑制治療后MTB感染復(fù)發(fā)。 該疫苗能夠拮抗MTB感染小鼠模型中化療所引起的分泌IL-2的CD4+和CD8+T細(xì)胞比例的降低，免疫治療聯(lián)合化療可引起表達(dá)TNF-α的CD4+T細(xì)胞比例降低和表達(dá)TNF-α的CD8+T細(xì)胞比例升高，但單用免疫治療或聯(lián)合化療對(duì)小鼠臟器荷菌量均無顯著影響，該疫苗對(duì)MTB感染小鼠的免疫治療效果還需進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 疫苗 免疫治療 Ag85B ESAT-6 Hsp65
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-28
• 第一部分 融合蛋白 Ag85B-ESAT-6 的免疫學(xué)特性研究28-39
• 1 材料28-31
• 2 方法31-34
• 3 結(jié)果34-38
• 4 討論38-39
• 第二部分 融合蛋白亞單位疫苗對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠免疫治療效果的評(píng)價(jià)39-53
• 1 材料39-40
• 2 方法40-43
• 3 結(jié)果43-50
• 4 討論50-53
• 第三部分 融合蛋白亞單位疫苗對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染小鼠免疫治療效果的評(píng)價(jià)53-62
• 1 材料53-54
• 2 方法54-56
• 3 結(jié)果56-59
• 4 討論59-62
• 小結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-74
• 個(gè)人簡歷和研究成果74-75
• 致謝75

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 王慶敏,胡振林,周鳳娟,肖存杰,章建程,孫樹漢;ESAT6抗原DNA疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年06期

2 郭文龍;朱瑞良;;基因工程亞單位疫苗的研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)[J];國外畜牧學(xué)(豬與禽);2008年04期

3 王麗梅;徐志凱;柏銀蘭;張海;康健;師長宏;;結(jié)核分枝桿菌HSP65-IL-2融合基因疫苗的構(gòu)建及表達(dá)[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2008年18期

4 肖和平;;耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2009)[J];中國防癆雜志;2010年04期

5 師長宏,范雄林,史皆然,徐志凱,李元,柏銀蘭,薛瑩;分枝桿菌胞壁融合表達(dá)Ag85B-ESAT-6穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2004年04期

6 徐苗,陳保文,沈小兵,蘇城,羅永艾,王國治;恥垢分枝桿菌作為免疫調(diào)節(jié)劑的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年09期

7 李文桂;陳蕊;陳雅棠;;結(jié)核分枝桿菌重組恥垢分枝桿菌疫苗的研究進(jìn)展[J];中國病原生物學(xué)雜志;2006年02期

8 王黎霞;成詩明;陳明亭;趙雁林;張慧;姜世聞;何廣學(xué);呂青;杜昕;陳偉;劉小秋;阮云洲;王勝芬;夏aa;于蘭;李峻;李雪;;2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J];中國防癆雜志;2012年08期

  本文關(guān)鍵詞：融合蛋白亞單位疫苗對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染豚鼠和小鼠免疫治療效果的初步評(píng)價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：313188