本文關(guān)鍵詞：抗人MASP2-C蛋白單克隆抗體的制備、鑒定及初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：對(duì)病原體是否易感取決于機(jī)體的抵抗力,而天然免疫是抵御病原體入侵的第一道防線。近年來天然免疫研究迅速崛起,提示從天然免疫的角度審視感染性疾病及其防治,可能會(huì)有意外收獲。補(bǔ)體激活的第三條途徑——凝集素途徑為天然免疫系統(tǒng)中的重要成分,而甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)相關(guān)絲氨酸蛋白酶2(MBL-associated serine protease2, MASP2)是其關(guān)鍵蛋白酶。 MASP2與Clr、Cls同屬絲氨酸蛋白酶超家族[2],在血漿中以酶原形式存在。已發(fā)現(xiàn)MASP家族3個(gè)絲氨酸蛋白酶：MASP1、MASP2、MASP3,以及2個(gè)非酶蛋白：MAp19、MAp44;其中MASP2、MAp19是同一基因的差異剪切產(chǎn)物,MASP1、MASP3及MAp44也來源于同一基因的不同剪切；五者均可與MBL形成大分子復(fù)合物(MBL-MASPs)。MASP2分子為單肽鏈,從N端至C端由6個(gè)功能區(qū)組成,依次為：CUB區(qū)(complement subcomponent CIr/C1s-like domain)、EGF區(qū)(epidermal growth factor-like domain)、CUB區(qū)、2個(gè)CCP區(qū)(complement control protein domain)、SP區(qū)(serine proteases)。研究表明,MASP蛋白N端及C端的功能相對(duì)獨(dú)立:MASPN端的3個(gè)結(jié)構(gòu)域即2個(gè)CUB區(qū)和1個(gè)EGF區(qū)是MASP與MBL-CLR結(jié)合的區(qū)域,能以Ca2+依賴方式與MBL相互作用,形成MBL-MASPs復(fù)合物；而C末端的3個(gè)結(jié)構(gòu)域即2個(gè)CCP區(qū)和1個(gè)SP區(qū)是絲氨酸蛋白酶的活性中心,激活補(bǔ)體主要依靠SP區(qū)發(fā)揮絲氨酸蛋白酶的作用,裂解補(bǔ)體C4和C2,產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶。 在凝集素途徑中,MBL/纖維膠原素與MASP1/MASP2等組成類似C1的復(fù)合物,前者通過CRD識(shí)別并結(jié)合病原微生物表面的甘露糖、N-乙酰葡萄糖等相應(yīng)糖結(jié)構(gòu)后,后者相繼被激活,活化的MASP2裂解補(bǔ)體C4和C2形成C3轉(zhuǎn)化酶C4b2a,由此形成補(bǔ)體激活凝集素途徑。故MASP2為MBL和幾種(H、M和L)纖維膠原素激活補(bǔ)體所必需,在凝集素途徑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。 近來研究表明,血清MASP2含量的變化與感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等多種疾病密切相關(guān)。MASP2基因GAC120GGC點(diǎn)突變導(dǎo)致編碼產(chǎn)物由天冬氨酸(Asp)變?yōu)楦拾彼?Gly),該點(diǎn)突變位于CUB1結(jié)構(gòu)域,可引起血清MASP2濃度降低或缺失,且突變MASP2蛋白與MBL及纖維膠原素的結(jié)合力降低,使免疫識(shí)別復(fù)合物分離,導(dǎo)致不能激活凝集素途徑,從而引起或加重病原體的感染。已有研究表明,血清MASP2水平是預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)、存活時(shí)間的獨(dú)立標(biāo)志；其也與食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展以及腫瘤的侵襲性密切相關(guān)。此外,MASP2基因多態(tài)性也與HCV易感性相關(guān),HCV患者血清中MASP2濃度增高。 現(xiàn)有資料表明,不同地域、不同種族人群,其MASP2基因不同位點(diǎn)存在的點(diǎn)突變具有明顯差異,突變頻率、血清水平也存在差異。而目前國(guó)內(nèi)并無(wú)中國(guó)人或各民族MASP2血漿濃度、與天然免疫及相關(guān)疾病的關(guān)系較全面的報(bào)道。 由于MASP2具有上述重要作用,有必要對(duì)其進(jìn)一步深入研究,而MASP2單克隆抗體(單抗)便是重要的工具之一。本研究以純化的重組人MASP2-C蛋白為抗原,制備了特異性識(shí)別人MASP2-C端蛋白的單克隆抗體,通過Western Blot、ELISA證實(shí)單抗特異性好,靈敏度高,具有一定的生物學(xué)功能。而關(guān)于人血漿MASP2濃度的測(cè)定方法,目前國(guó)內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道,本研究利用抗MASP2-C單抗及多抗,建立雙單抗、單多抗及多單抗夾心ELISA法檢測(cè)人血漿MASP2濃度,篩選并優(yōu)化最佳體系,初步可用于檢測(cè)人血漿MASP2濃度。本研究為深入探討MASP2的生物學(xué)作用及MASP2缺損有關(guān)疾病的診斷提供了有效的工具和手段。 第一章MASP1、MASP2C端蛋白的原核表達(dá)及鑒定 MASP2在人血清中含量較低,普通人群在1μg/ml以下；并與MASP1、 MASP3、sMAp、MBL等共同存在于MBL-MASPs復(fù)合物中。因此,從血漿中獲取高純度的天然MASP2蛋白困難較大。鑒于此,我們采用分子生物學(xué)技術(shù),應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)來獲得目的蛋白。MASP2在血漿中以酶原形式存在,在體內(nèi)及體外操作過程中可以自動(dòng)激活,不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行；考慮到MASP2N端和C端的不同結(jié)構(gòu)域的功能相對(duì)獨(dú)立,我們采用分段表達(dá)的策略來制備MASPl-C、MASP2-C蛋白。 我們以含人MASP1、MASP2全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA的pGEM-MASP1、 pGEM-MASP2質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出人MASP1和MASP2的C端基因片段,將其分別克隆至pET-17b質(zhì)粒中,經(jīng)PCR及基因測(cè)序鑒定序列正確后,導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3),在氨芐青霉素抗性的篩選培養(yǎng)基上獲得了表達(dá)目的基因的pET17b-MASP1C和pET17b-MASP2C重組大腸桿菌,以IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)MASP1-C/His、MASP2-C/His融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定證明融合蛋白存在于包涵體中。對(duì)以包涵體形式存在的MASP1-C/His、MASP2-C/His融合蛋白經(jīng)8mol/L尿素變性后再行遞減尿素濃度梯度復(fù)性,獲得結(jié)構(gòu)折疊正確的重組蛋白,ELISA鑒定其能與抗His抗體特異性結(jié)合。將重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA agarose層析柱純化,獲得了純化的MASP1-C和MASP2-C融合蛋白。 第二章特異性識(shí)別MASP2-C單克隆抗體制備和鑒定 以純化的重組MASP2-C蛋白為抗原,將其與等體積佐劑充分乳化,免疫6只BALB/c小鼠,免疫3次后以間接ELISA法測(cè)血清抗體效價(jià)達(dá)1.0×105以上時(shí),即可取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(NS-1)融合,按常規(guī)方法制備雜交瘤。以MASP2-C為抗原包被酶標(biāo)板,并以帶His標(biāo)簽的無(wú)關(guān)蛋白(CLR/His)做抗原進(jìn)行平行篩選。間接ELISA、Western blot對(duì)各抗MASP2-C單抗進(jìn)行特異性鑒定分析。結(jié)果總計(jì)獲得15株可能分泌抗MASP2-C單抗的雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)抗體亞類(型)鑒定,15株單抗均為IgGl類,輕鏈為κ鏈。所獲雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后注射至BALB/c小鼠腹腔制備腹水,用辛酸-硫酸銨沉淀法從腹水中純化抗體。 間接ELISA結(jié)果顯示除單抗2B11、2B3與MASP1-C、MASP2-N存在交叉反應(yīng)外,其余13株抗體均只與MASP2-C反應(yīng),與CLR/His無(wú)反應(yīng)；SDS-PAGE及Western blot顯示：除在目的位置處有特異性條帶外無(wú)其他雜帶,表明單抗特異性良好。我們選取單抗1D1、4C11、2C11、3G4進(jìn)行功能試驗(yàn)：通過分析MBL-MASPs復(fù)合物與甘露聚糖結(jié)合的方法來檢測(cè)單抗與血漿MBL-MASPs復(fù)合物中天然MASP2的結(jié)合活性及通過C4b沉積實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mAb對(duì)補(bǔ)體凝集素途徑阻斷活性[13],二者分別提示單抗1D1、4C11、2C11、3G4與血漿中天然MASP2結(jié)合活性好,并能通過抑制MASP2裂解C4而阻斷補(bǔ)體凝集素途徑。 第三章建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)血漿MASP2濃度 我們已獲得了15株抗MASP2-C的單克隆抗體,為了建立敏感的雙抗體夾心體系來檢測(cè)血漿MASP2蛋白,我們又以純化的重組MASP2-C蛋白為免疫原,免疫新西蘭兔獲得兔抗人MASP2-C多克隆抗體；并選擇將單抗2B11、3D4、5A1、4C8標(biāo)記生物素。然后分別以多單抗、單多抗夾心、雙單抗夾心ELISA方法檢測(cè)MASP2-C,從多種配對(duì)方法中篩選出陽(yáng)性值較高、陰性值較低、并對(duì)血漿天然MASP2敏感的最佳配對(duì),對(duì)此配對(duì)進(jìn)行了體系的優(yōu)化。結(jié)果表明：在抗體包被濃度為1μg/ml,封閉液為0.25%酪蛋白,洗液為0.5%oPBST,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為PBS,檢測(cè)抗體濃度為0.5μg/ml時(shí)即可良好檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品及血漿樣本中的MASP2,在此條件下建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度、可重復(fù)性均較好,檢測(cè)范圍在10-1500ng/ml,符合臨床檢測(cè)的需要。
【關(guān)鍵詞】：MASP2-C 單克隆抗體 ELISA 血清MASP2濃度
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-16
• 第一章 人MASP2-C蛋白的原核表達(dá)及鑒定16-30
• 1.1 材料和方法16-25
• 1.2 結(jié)果25-28
• 1.3 討論28-30
• 第二章 抗MASP2-C蛋白單克隆抗體的制備和鑒定30-47
• 2.1 材料和方法30-38
• 2.2 結(jié)果38-45
• 2.3 討論45-47
• 第三章 建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)血漿MASP2濃度47-62
• 3.1 材料與方法47-52
• 3.2 結(jié)果52-60
• 3.3 討論60-62
• 全文總結(jié)62-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 中引文縮略詞69-71
• 在讀期間發(fā)表的文章71-72
• 致謝72-74

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