本文關鍵詞：解耦聯(lián)蛋白2對線粒體氧化損傷誘導端粒依賴性衰老的干預和機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 本研究擬觀察長期血管緊張素II（AngII）對人臍靜脈血管內皮細胞（HUVECs）衰老的影響和相關機制，并進一步探討高表達UCP2對細胞衰老、凋亡的影響和相關機制，以揭示UCP2在端粒依賴性衰老的作用。 方法： 1、用血管緊張素II（AngII），干預血清饑餓后的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）1周，并分為四組，①DMEM組；②AngII（0.1μmol/L）組；③AngII（1μmol/L）組;④AngII（10μmol/L）組。流式細胞儀法檢測活性氧，線粒體膜電位和凋亡率，通過細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測各組衰老細胞數(shù)量（光學顯微鏡觀察），通過Western blot檢測各組細胞的TERT、UCP2、c-myc、c-fos、p65、p53、Akt、p-Akt、ERK和p-ERK蛋白的表達情況。 2、為了觀察PI3K/Akt信號通路在氧化誘導細胞衰老機制中的作用，用血管緊張素II（AngII）干預血清饑餓后的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）前，通過LY294002(PI3K/Akt抑制劑)來抑制細胞的PI3K/Akt信號通路，并根據(jù)LY294002濃度不同，將實驗組分為六組，ⅠDMEM組；Ⅱ AngII1μmol/L組；Ⅲ LY2940025μmol/L+AngII1μmol/L組；Ⅳ LY29400210μmol/L+AngII1μmol/L組；ⅤLY29400220μmol/L+AngII1μmol/L組；Ⅵ LY29400230μmol/L+AngII1μmol/L組。通過細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測各組衰老細胞數(shù)量（光學顯微鏡觀察）。通過Western blot檢測各組細胞的TERT、UCP2、c-myc、c-fos、p65、p53、Akt、p-Akt、ERK和p-ERK蛋白的表達情況。 3、用血管緊張素II（AngII）和擬高表達解耦聯(lián)蛋白2（UCP2）作用的外源性解偶聯(lián)劑CLCCP，干預血清饑餓后的HUVECs1周，將實驗分組設為⑴DMEM組；⑵AngII（1μmol/L）組；⑶CLCCP(10μmol/L)+AngII（1μmol/L）組；⑷AngII（1μmol/L）+DMSO組。通過上述相同的方法檢測各組活性氧、線粒體膜電位、凋亡率和衰老細胞水平。通過Western blot檢測各組細胞的TERT、Akt、p-Akt、ERK和p-ERK蛋白的表達情況。 結果： 1、AngII（10μmol/L）組，AngII（1μmol/L），AngII（0.1μmol/L）組，DMEM組在干預一周后檢測ROS水平分別為1595±16.7、1312±14.3、1096±13.8、943±12.3(各組間比較P均0.01)；線粒體膜電位水平分別為948±13.2、826±11.8、652±9.9、298±6.1(各組間比較P均0.01)；各組凋亡率（Annexin V-FITC）分別為50.01±5.9、31.4±1.5、22.2±3.2、15.8±2.0(各組間比較P均0.01)；β-半乳糖苷酶染色的衰老細胞隨著AngII濃度的升高而增多；隨著AngII濃度的增高，TERT、UCP2、P-ERK、P-Akt、c-myc、c-fos、P53、P65的表達水平都有所升高，都要顯著高于對照組,P65在高水平AngII干預下表達明顯升高。 2、隨著PI3K/Akt抑制劑LY294002的濃度的升高，，各組細胞染色情況我們可以看出，細胞數(shù)明顯減少，染色衰老的細胞逐漸的減少；通過LY294002抑制PI3K/Akt通路后，p-Akt、TERT、UCP2、c-fos、p65、c-myc、p53的表達顯著降低，在高濃度LY294002時AKt的表達量也有所降，P-ERK的表達與LY294002濃度具有正相關性，且差異很顯著。 3、線粒體解耦聯(lián)組的ROS水平（1123±12.5）要低于AngII組（1258±13.6，p＜0.01）；線粒體解耦聯(lián)組的膜電位水平（626±9.8）要低于AngII組（835±12.2，p＜0.01）；線粒體解耦聯(lián)組的凋亡率（21.45±1.8）要低于AngII組（32.2±1.6，p＜0.01）；線粒體解耦聯(lián)組通過β-半乳糖苷酶染色的衰老細胞要明顯少于AngII組；Western blot下，線粒體解耦聯(lián)組相對于AngII組，TERT、P-Akt、P-ERK的表達水平明顯增加。 結論： 1、長期的氧化損傷下可以誘導細胞衰老和凋亡，外源性UCP2可以降低線粒體膜電位水平和ROS水平，抑制細胞的衰老和凋亡，其過程涉及PI3K/Akt信號通路，ERK信號通路和TERT的高活性。 2、依賴ROS的PI3K/AKt增殖信號促進細胞衰老。 3、ROS能激活PI3K/Akt和ERK信號途徑通路，P65、c-myc、c-fos、TERT和UCP2位于PI3K/Akt通路作用的下游，它們可能是氧化損傷下抗衰老和凋亡的重要通路和生存因子。
【關鍵詞】：衰老 端粒 解耦聯(lián)蛋白2 氧化應激 線粒體
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 縮略詞對照表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料和方法13-23
• 2.1 實驗材料13-22
• 2.1.1 細胞株來源13
• 2.1.2 主要實驗儀器13
• 2.1.3 主要實驗試劑13-14
• 2.1.4 自配試劑14-16
• 2.2.1 人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)16-18
• 2.2.2 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的處理18-19
• 2.2.3 檢測指標與方法19-22
• 2.3 統(tǒng)計學分析22-23
• 第3章 實驗結果23-36
• 3.1 血管緊張素 II 對線粒體活性氧和膜電位的影響23-24
• 3.2 血管緊張素 II 對凋亡率的影響24-25
• 3.3 血管緊張素 II 對細胞衰老的影響25-26
• 3.4 血管緊張素 II 對 HUVEC 中 TERT、UCP2、ERK、AKt、p-ERK、p-Akt、c-myc、c-fos、p53、p65 蛋白表達水平的影響26-27
• 3.5 不同濃度 PI3K/AKT 抑制劑對 HUVECs 衰老細胞β-半乳糖苷酶的染色影響27-29
• 3.6 不同濃度 PI3K/AKT 抑制劑對 HUVECs 中 TERT、UCP2、ERK、AKt、p-ERK、p-Akt、c-myc、c-fos、p53、p65 蛋白表達水平的影響29-30
• 3.7 線粒體解耦聯(lián)對血管緊張素 II 處理下的 HUVECs 活性氧和膜電位的影響30-32
• 3.8 線粒體解耦聯(lián)對血管緊張素 II 處理下的 HUVECs 凋亡率的影響32-33
• 3.9 線粒體解耦聯(lián)對血管緊張素 II 處理下的衰老細胞β-半乳糖苷酶的染色影響33-34
• 3.10 線粒體解耦聯(lián)對 TERT、ERK、AKt、p-ERK、p-Akt 蛋白表達水平的影響34-36
• 第4章 討論36-41
• 4.1 PI3K/AKT 和 ERK 信號通路與細胞衰老36
• 4.2 活性氧和 p53 對細胞衰老和凋亡的影響36-37
• 4.3 PI3K/AKT 和 ERK 信號通路與 UCP2 等生存因子在端粒依賴性衰老中作用37-38
• 4.4 UCP2 對端粒依賴性衰老的影響38-39
• 4.5 UCP2 在端粒依賴性衰老的作用機制39-41
• 第5章 結論41-42
• 致謝42-43
• 參考文獻43-47
• 攻讀學位期間的研究成果47-48
• 綜述48-56
• 參考文獻54-56

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本文編號：309278