本文關鍵詞：新型重組豬α-干擾素的制備及其活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：干擾素是機體在一系列誘導因素的作用下，產生的一類具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節(jié)功能的細胞因子。從1957年Isaacs和Lindenmann發(fā)現至今，已有很多關于干擾素的研究報道，其中大多數是著重于干擾素的規(guī)�；a研究，以滿足在疾病治療方面的需求。IFN作為動物體內所知作用最快的第一道防御體系，對病毒性疾病的治療起到極其重要的作用。但是IFN機體自身表達量較低，無法滿足防治疾病的要求。所以利用基因工程技術，體外大規(guī)模獲得IFN十分必要。目前所知的干擾素表達系統(tǒng)有大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、動物細胞表達系統(tǒng)和植物表達系統(tǒng)。其中大腸桿菌表達系統(tǒng)目前研究較為深入，具有培養(yǎng)條件簡單，操作容易，培養(yǎng)周期短，成本低，產量高，易于規(guī)�；扔袃�(yōu)點。不足之處是其表達的蛋白常以包涵體的形式存在。本實驗，構建了pET32-PoIFNα/BL21(DE3)重組菌株，并可溶性的表達出了PoIFNα。純化，WB鑒定后，進行了生物活性測定，結果表明具有較好的抗病毒活性。主要結果如下： 根據GeneBank中報道的豬α干擾素基因序列（M28623），設計一對引物。以豬肝臟基因組DNA為模板，PCR擴增出豬α干擾素成熟肽基因�？寺〉絧ET32質粒中，構建了重組質粒pET32α-PoIFNα。經PCR鑒定，雙酶切鑒定和測序鑒定后，轉化入BL21（DE3），，篩選得到含表達質粒的基因工程菌pET32-PoIFNα/BL21(DE3)。 誘導重組菌株表達，產物經SDS-PAGE蛋白電泳分析，在3.8×104的位置出現了目的蛋白條帶，與預期相符。并且，通過還原上樣緩沖液和非還原上樣緩沖液兩種方法處理樣品，證明表達蛋白是以有活性的單體形式存在的。經過溫度、IPTG、誘導時間的摸索，確定了可溶性表達的最佳條件為22℃、0.5mM IPTG、誘導10h。在最佳條件下，大規(guī)模誘導工程菌，表達產物經鎳柱親和層析純化，得到了純度較高的重組蛋白。WB鑒定，進一步證實了表達產物確實為PoIFNα。純化產物透析除鹽后凍干，4℃冰箱保存。 使用干擾素預處理Marc145細胞，然后用100CCID_(50)的PRRSV攻擊，結果表明，PoIFNα具有抗病毒活性。為下一步PoIFNα的開發(fā)奠定了基礎。
【關鍵詞】：豬干擾素α pET32α 基因工程藥物 基因重組
【學位授予單位】：重慶理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 緒論10-20
• 1.1 豬 IFN-α的研究進展10-16
• 1.1.1 豬干擾素研究概況10
• 1.1.2 豬α干擾素作用機制10-11
• 1.1.3 豬α干擾素生物活性11-13
• 1.1.4 基因工程豬 IFNα的研究進程13-14
• 1.1.5 豬α干擾素在臨床應用14-15
• 1.1.6 豬α干擾素的前景展望15-16
• 1.2 課題研究意義及其立項依據16-17
• 1.3 研究內容及其技術路線17-20
• 1.3.1 研究內容和方法17-18
• 1.3.2 技術路線18-20
• 第二章 pET32a-PoIFNα基因工程菌的構建20-32
• 2.1 實驗材料20-22
• 2.1.1 載體與菌株20
• 2.1.2 工具酶及其他20
• 2.1.3 主要儀器20
• 2.1.4 主要試劑的配置20-22
• 2.2 實驗方法22-26
• 2.2.1 引物設計22
• 2.2.2 豬肝臟基因組 DNA 的提取22
• 2.2.3 豬α-干擾素成熟肽基因的克隆22-23
• 2.2.4 DNA 電泳23
• 2.2.5 目的片段的回收23-24
• 2.2.6 質粒的提取24
• 2.2.7 質粒和 PCR 產物的雙酶切24-25
• 2.2.8 DNA 片段的連接25
• 2.2.9 感受態(tài)細胞的制備25
• 2.2.10 感受態(tài)細胞的轉化25-26
• 2.2.11 陽性克隆的鑒定26
• 2.3 實驗結果26-30
• 2.3.1 豬肝臟基因組 DNA 提取和 IFN-α成熟肽基因擴增結果26-27
• 2.3.2 重組 pET32a-IFN-α質粒的鑒定27-28
• 2.3.3 重組質粒 pET32a-IFN-α基因測序結果與分析28-30
• 2.4 本章討論30-32
• 2.4.1 重組 pET32a-IFN-α質粒的設計30
• 2.4.2 重組 pET32a-IFN-α質粒的構建30
• 2.4.3 重組 pET32a-IFN-α質粒的鑒定30-32
• 第三章 工程菌的誘導表達及其產物純化32-48
• 3.1 實驗材料32-35
• 3.1.1 重組基因工程菌32
• 3.1.2 實驗耗材與儀器32-33
• 3.1.3 主要試劑及其配制33-35
• 3.2 實驗方法35-41
• 3.2.0 pET32a-IFN-α/BL21(DE3) 重組菌株的誘導表達35-36
• 3.2.1 IFN-α可溶性表達的誘導條件優(yōu)化36-38
• 3.2.2 pET32a-IFN-α/BL21(DE3) 重組菌株的大量誘導表達38
• 3.2.3 IFN-α的純化38-39
• 3.2.4 分子鑒定39
• 3.2.5 IFN-α凍干粉的制備39-40
• 3.2.6 考馬斯亮藍法測定蛋白質含量40-41
• 3.3 實驗結果41-45
• 3.3.1 pET32a-IFN-α/BL21(DE3) 重組菌株可溶性分析及其優(yōu)化41-43
• 3.3.2 豬 IFNα純化結果43
• 3.3.3 分子鑒定43
• 3.3.4 蛋白含量測定43-45
• 3.4 本章討論45-48
• 3.4.1 豬 IFN-α可溶性表達的誘導條件優(yōu)化45
• 3.4.2 豬 IFN-α的純化45-46
• 3.4.3 蛋白濃度測定方法46-48
• 第四章 豬 IFN-α活性測定48-56
• 4.1 實驗材料48-49
• 4.1.1 實驗細胞和病毒48
• 4.1.2 實驗耗材與儀器48
• 4.1.3 主要試劑的配制48-49
• 4.2 實驗方法49-51
• 4.2.1 Marc145 細胞的培養(yǎng)49-50
• 4.2.2 PRRSV 病毒的增殖50
• 4.2.3 PRRSV 的 CCID_(50)測定50-51
• 4.2.4 豬 IFN-α的活性測定51
• 4.3 實驗結果51-53
• 4.3.1 Marc145 細胞的培養(yǎng)與 PRRSV 病毒的增殖51-52
• 4.3.2 CCID_(50)測定結果52
• 4.3.3 豬 IFN-α活性測定結果52-53
• 4.4 本章討論53-56
• 4.4.1 Marc145 細胞的培養(yǎng)53
• 4.4.2 干擾素活性測定方法53-56
• 第五章 全文總結及后續(xù)工作建議56-58
• 5.1 全文總結56
• 5.2 不足之處56
• 5.3 后續(xù)工作計劃56-58
• 致謝58-60
• 參考文獻60-64
• 附錄64-66
• 附錄 1 Reed-Muench 兩氏法64
• 附錄 2 細菌結晶紫染色法64-65
• 附錄 3 細胞計數法65-66
• 英文縮寫索引66-68
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文及取得的研究成果68

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 陸輝;朱善元;左偉勇;洪偉鳴;吳雙;;豬α干擾素表達蛋白ab的抗病毒效果研究[J];安徽農業(yè)科學;2012年03期

2 劉占通;崔保安;文英會;陳紅英;金喜新;牛春玲;魏戰(zhàn)勇;;不同品種豬IFN-α基因的克隆與序列分析[J];動物醫(yī)學進展;2006年12期

3 岑路;賀亮亮;鄧蘇理;朱艷平;張獻杰;郭霄峰;;重組豬α干擾素治療高致病性豬藍耳病的研究[J];動物醫(yī)學進展;2008年06期

4 楊東亮;林永利;;干擾素的研究進展及其在動物臨床中的應用[J];福建畜牧獸醫(yī);2009年01期

5 孫鎏國;馬云;胡方建;;豬用干擾素對繁殖障礙與呼吸道綜合征的療效觀察[J];中國畜牧獸醫(yī);2007年06期

6 沈建革;沈強;;豬白細胞干擾素防治羊羔腹瀉效果觀察[J];養(yǎng)殖技術顧問;2006年11期

7 閆麗輝;危艷武;劉飛;劉春國;朱慶虎;王牟平;孫建宏;;重組豬α干擾素在大腸桿菌中的表達及純化[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2011年01期

8 謝海燕,郭霄峰;豬α-干擾素的原核表達[J];華南農業(yè)大學學報;2004年04期

9 黃定余,馮運紅;豬白細胞干擾素緊急防治小鵝瘟試驗[J];湖北畜牧獸醫(yī);2000年04期

10 姜天童;;應用豬白細胞干擾素配合相關抗菌藥物防治豬高熱病[J];湖北畜牧獸醫(yī);2009年04期

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本文編號：309778