發(fā)布時(shí)間：2017-04-16 02:15

  本文關(guān)鍵詞：新型重組豬α-干擾素的制備及其活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：干擾素是機(jī)體在一系列誘導(dǎo)因素的作用下，產(chǎn)生的一類具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。從1957年Isaacs和Lindenmann發(fā)現(xiàn)至今，已有很多關(guān)于干擾素的研究報(bào)道，其中大多數(shù)是著重于干擾素的規(guī)�；a(chǎn)研究，以滿足在疾病治療方面的需求。IFN作為動(dòng)物體內(nèi)所知作用最快的第一道防御體系，對(duì)病毒性疾病的治療起到極其重要的作用。但是IFN機(jī)體自身表達(dá)量較低，無法滿足防治疾病的要求。所以利用基因工程技術(shù)，體外大規(guī)模獲得IFN十分必要。目前所知的干擾素表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和植物表達(dá)系統(tǒng)。其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)目前研究較為深入，具有培養(yǎng)條件簡單，操作容易，培養(yǎng)周期短，成本低，產(chǎn)量高，易于規(guī)模化等有優(yōu)點(diǎn)。不足之處是其表達(dá)的蛋白常以包涵體的形式存在。本實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了pET32-PoIFNα/BL21(DE3)重組菌株，并可溶性的表達(dá)出了PoIFNα。純化，WB鑒定后，進(jìn)行了生物活性測(cè)定，結(jié)果表明具有較好的抗病毒活性。主要結(jié)果如下： 根據(jù)GeneBank中報(bào)道的豬α干擾素基因序列（M28623），設(shè)計(jì)一對(duì)引物。以豬肝臟基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出豬α干擾素成熟肽基因。克隆到pET32質(zhì)粒中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET32α-PoIFNα。經(jīng)PCR鑒定，雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)化入BL21（DE3），，篩選得到含表達(dá)質(zhì)粒的基因工程菌pET32-PoIFNα/BL21(DE3)。 誘導(dǎo)重組菌株表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳分析，在3.8×104的位置出現(xiàn)了目的蛋白條帶，與預(yù)期相符。并且，通過還原上樣緩沖液和非還原上樣緩沖液兩種方法處理樣品，證明表達(dá)蛋白是以有活性的單體形式存在的。經(jīng)過溫度、IPTG、誘導(dǎo)時(shí)間的摸索，確定了可溶性表達(dá)的最佳條件為22℃、0.5mM IPTG、誘導(dǎo)10h。在最佳條件下，大規(guī)模誘導(dǎo)工程菌，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析純化，得到了純度較高的重組蛋白。WB鑒定，進(jìn)一步證實(shí)了表達(dá)產(chǎn)物確實(shí)為PoIFNα。純化產(chǎn)物透析除鹽后凍干，4℃冰箱保存。 使用干擾素預(yù)處理Marc145細(xì)胞，然后用100CCID_(50)的PRRSV攻擊，結(jié)果表明，PoIFNα具有抗病毒活性。為下一步PoIFNα的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬干擾素α pET32α 基因工程藥物 基因重組
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 緒論10-20
• 1.1 豬 IFN-α的研究進(jìn)展10-16
• 1.1.1 豬干擾素研究概況10
• 1.1.2 豬α干擾素作用機(jī)制10-11
• 1.1.3 豬α干擾素生物活性11-13
• 1.1.4 基因工程豬 IFNα的研究進(jìn)程13-14
• 1.1.5 豬α干擾素在臨床應(yīng)用14-15
• 1.1.6 豬α干擾素的前景展望15-16
• 1.2 課題研究意義及其立項(xiàng)依據(jù)16-17
• 1.3 研究內(nèi)容及其技術(shù)路線17-20
• 1.3.1 研究內(nèi)容和方法17-18
• 1.3.2 技術(shù)路線18-20
• 第二章 pET32a-PoIFNα基因工程菌的構(gòu)建20-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.1.1 載體與菌株20
• 2.1.2 工具酶及其他20
• 2.1.3 主要儀器20
• 2.1.4 主要試劑的配置20-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-26
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)22
• 2.2.2 豬肝臟基因組 DNA 的提取22
• 2.2.3 豬α-干擾素成熟肽基因的克隆22-23
• 2.2.4 DNA 電泳23
• 2.2.5 目的片段的回收23-24
• 2.2.6 質(zhì)粒的提取24
• 2.2.7 質(zhì)粒和 PCR 產(chǎn)物的雙酶切24-25
• 2.2.8 DNA 片段的連接25
• 2.2.9 感受態(tài)細(xì)胞的制備25
• 2.2.10 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化25-26
• 2.2.11 陽性克隆的鑒定26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-30
• 2.3.1 豬肝臟基因組 DNA 提取和 IFN-α成熟肽基因擴(kuò)增結(jié)果26-27
• 2.3.2 重組 pET32a-IFN-α質(zhì)粒的鑒定27-28
• 2.3.3 重組質(zhì)粒 pET32a-IFN-α基因測(cè)序結(jié)果與分析28-30
• 2.4 本章討論30-32
• 2.4.1 重組 pET32a-IFN-α質(zhì)粒的設(shè)計(jì)30
• 2.4.2 重組 pET32a-IFN-α質(zhì)粒的構(gòu)建30
• 2.4.3 重組 pET32a-IFN-α質(zhì)粒的鑒定30-32
• 第三章 工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及其產(chǎn)物純化32-48
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料32-35
• 3.1.1 重組基因工程菌32
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材與儀器32-33
• 3.1.3 主要試劑及其配制33-35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法35-41
• 3.2.0 pET32a-IFN-α/BL21(DE3) 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)35-36
• 3.2.1 IFN-α可溶性表達(dá)的誘導(dǎo)條件優(yōu)化36-38
• 3.2.2 pET32a-IFN-α/BL21(DE3) 重組菌株的大量誘導(dǎo)表達(dá)38
• 3.2.3 IFN-α的純化38-39
• 3.2.4 分子鑒定39
• 3.2.5 IFN-α凍干粉的制備39-40
• 3.2.6 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量40-41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 3.3.1 pET32a-IFN-α/BL21(DE3) 重組菌株可溶性分析及其優(yōu)化41-43
• 3.3.2 豬 IFNα純化結(jié)果43
• 3.3.3 分子鑒定43
• 3.3.4 蛋白含量測(cè)定43-45
• 3.4 本章討論45-48
• 3.4.1 豬 IFN-α可溶性表達(dá)的誘導(dǎo)條件優(yōu)化45
• 3.4.2 豬 IFN-α的純化45-46
• 3.4.3 蛋白濃度測(cè)定方法46-48
• 第四章 豬 IFN-α活性測(cè)定48-56
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料48-49
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和病毒48
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材與儀器48
• 4.1.3 主要試劑的配制48-49
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法49-51
• 4.2.1 Marc145 細(xì)胞的培養(yǎng)49-50
• 4.2.2 PRRSV 病毒的增殖50
• 4.2.3 PRRSV 的 CCID_(50)測(cè)定50-51
• 4.2.4 豬 IFN-α的活性測(cè)定51
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-53
• 4.3.1 Marc145 細(xì)胞的培養(yǎng)與 PRRSV 病毒的增殖51-52
• 4.3.2 CCID_(50)測(cè)定結(jié)果52
• 4.3.3 豬 IFN-α活性測(cè)定結(jié)果52-53
• 4.4 本章討論53-56
• 4.4.1 Marc145 細(xì)胞的培養(yǎng)53
• 4.4.2 干擾素活性測(cè)定方法53-56
• 第五章 全文總結(jié)及后續(xù)工作建議56-58
• 5.1 全文總結(jié)56
• 5.2 不足之處56
• 5.3 后續(xù)工作計(jì)劃56-58
• 致謝58-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 附錄64-66
• 附錄 1 Reed-Muench 兩氏法64
• 附錄 2 細(xì)菌結(jié)晶紫染色法64-65
• 附錄 3 細(xì)胞計(jì)數(shù)法65-66
• 英文縮寫索引66-68
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及取得的研究成果68

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：新型重組豬α-干擾素的制備及其活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：309778