本文關(guān)鍵詞：人源抗TLR4基因工程抗體Fab的制備、表達(dá)及特性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：TLR4是Toll樣受體家族成員之一，在對TLR4的研究中發(fā)現(xiàn)TLR4通過依耐MyD88途徑或不依耐MyD88途徑介導(dǎo)LPS的信號傳導(dǎo)，從而在病原體入侵機(jī)體的早期即可啟動免疫，其在抗感染治療中起非常關(guān)鍵的作用[1-4]。阻斷TLR4介導(dǎo)的內(nèi)毒素信號向細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)，是減輕內(nèi)毒素生物學(xué)效應(yīng)的有效的方法。本課題前期進(jìn)行的鼠源性的抗TLR4抗體的研究中，獲得鼠抗人TLR4的單克隆抗體，體外細(xì)胞試驗顯示其對LPS刺激產(chǎn)生的a-TNF有明顯的抑制作用[5]。但人體對鼠源性抗體會產(chǎn)生HAMA（human anti-mouse antibody），產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。噬菌體抗體庫展示技術(shù)是近年發(fā)展的單克隆抗體制備的一項新技術(shù)，它改變了單克隆抗體制備的傳統(tǒng)途徑，它模擬機(jī)體產(chǎn)生抗體的過程，從而使得在體外就可以獲得特異性的單克隆抗體[6]。本課題運用噬菌體抗體庫技術(shù)在人體庫中進(jìn)行篩選，成功獲得了人源抗TLR4抗體的Fab的基因片段，并構(gòu)建該Fab的原核表達(dá)載體，對其表達(dá)的蛋白進(jìn)行活性分析。 方法： 1、采用抗原固相篩選法：以純化的重組hTLR4蛋白為靶抗原，從人源噬菌體Fab抗體庫中篩選，經(jīng)“吸附、洗脫和擴(kuò)增”三個環(huán)節(jié)，經(jīng)五輪篩選后，隨機(jī)挑取的80個克隆，經(jīng)phage ELISA驗證，，獲得11株陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)11株陽性克隆的抗體可變區(qū)基因序列相同，最終獲得一株人源抗TLR4抗體Fab，將其命名為抗hTLR4Fab-1。 2、將篩選獲得的陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得VL和Fd，構(gòu)建pET-Duet1表達(dá)載體，將重新構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Origami2（DE3），誘導(dǎo)其表達(dá)抗hTLR4Fab-1。 3、將誘導(dǎo)表達(dá)的抗hTLR4Fab-1包涵體蛋白經(jīng)變性、復(fù)性后，用Protein L柱純化，純化后抗體Fab經(jīng)SDS-PAGE、Western-bolt及ELISA分析鑒定。 4、通過細(xì)胞學(xué)檢測抗hTLR4Fab-1對LPS誘導(dǎo)的人PBMC的TNF-α表達(dá)的影響，觀察該抗體是否能阻斷hTLR4對LPS的信號傳導(dǎo)，減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，判斷其活性。 結(jié)果： 1、將篩選獲得的11株陽性克隆擴(kuò)增后，進(jìn)行核酸序列測定和比對分析，結(jié)果顯示，所得到的陽性克隆的抗體可變區(qū)基因相同，其可變區(qū)基因序列正確。通過五輪篩選，獲得一株人源抗TLR4抗體Fab，命名為抗hTLR4Fab-1。 2、抗hTLR4Fab-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗體以包涵體的形式大量表達(dá)，經(jīng)變性、復(fù)性后，VL及Fd能正確的組裝；經(jīng)Protein L柱純化后，可獲得純度較高的抗體。 3、ELISA結(jié)果顯示，本實驗方法獲得的抗體能夠與hTLR4特異性結(jié)合。 4、體外細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果實驗表明：人源抗體hTLR4Fab-1能夠明顯阻斷LPS誘導(dǎo)的人PBMC細(xì)胞表達(dá)TNF-α，抑制率達(dá)76.25%。 結(jié)論： 1、通過噬菌體抗體庫技術(shù)，采用固相篩選方法可獲得抗hTLR4的特異性基因工程抗體Fab。 2、應(yīng)用原核表達(dá)技術(shù)，該Fab在大腸桿菌Origami2（DE3）中以包涵體的形式大量表達(dá)。通過優(yōu)選條件，對包涵體蛋白進(jìn)行變性、復(fù)性、純化，最終獲得高純度、有生物學(xué)活性的抗體。 3、抗hTLR4抗體片段Fab能與hTLR4特異性結(jié)合，并可抑制LPS誘導(dǎo)的人PBMC細(xì)胞表達(dá)TNF-α，減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 本研究制備的人源抗體TLR4抗體Fab可與hTLR4特異性結(jié)合，并能有效阻斷LPS誘導(dǎo)的人PBMC細(xì)胞表達(dá)TNF-α，減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用。
【關(guān)鍵詞】：噬菌體展示 人源化抗體Fab TLR4 LPS 活性分析
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-12
• 研究一 人源抗 TLR4 基因工程抗體 Fab 的篩選與鑒定12-25
• 1.材料與方法12-21
• 2.結(jié)果21-23
• 3.討論23-25
• 研究二 人源抗 TLR4 基因工程抗體 Fab 的表達(dá)、純化與特性分析25-37
• 1.材料與方法25-32
• 2.結(jié)果32-35
• 3.討論35-37
• 小結(jié)37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 附錄一：文獻(xiàn)綜述41-46
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 附錄二：縮略語46-47
• 在讀期間參與的工作和發(fā)表的文章47-48
• 致謝48

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：人源抗TLR4基因工程抗體Fab的制備、表達(dá)及特性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：308033