發(fā)布時間：2017-04-15 08:29

  本文關鍵詞：陰溝腸桿菌噬菌體的分離鑒定及生物學特性的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）是腸桿菌科革蘭陰性桿菌，廣泛分布于自然界，亦可存在于人和動物腸道中。陰溝腸桿菌是臨床感染常見的致病菌，可引起敗血癥、呼吸道感染、尿道感染和腹膜炎等疾病。近年來，由于陰溝腸桿菌對β-內酰胺酶類、喹諾酮類及氨基糖苷類抗生素均出現(xiàn)較高耐藥率，使得治療該細菌感染面臨難題。 噬菌體是一類可以侵襲細菌的病毒，廣泛分布于自然界中，，對其宿主菌具有高度的特異性和高效裂解性，有望成為新型的抗菌制劑。雖然噬菌體的研究開展已久，但國內外尚未見有關陰溝腸桿菌噬菌體的深入研究報道。 本研究以陰溝腸桿菌為宿主菌，從居民區(qū)污水中分離獲得4株陰溝腸桿菌噬菌體，通過噬斑法反復純化，篩選出1株裂解性強的毒性噬菌體，命名為ФEc53，并對其進行了生物學特性的研究及抗感染應用的初步研究。 噬菌體ФEc53的生物學特性 經3~5次反復純化后，在雙層瓊脂上可形成直徑約為2～4mm的圓形、透明、邊界清晰的噬菌斑。電子顯微鏡下，該噬菌體頭部呈球形，直徑約60nm，有一長尾約130nm。根據噬菌體的新分類法，ФEc53屬于有尾病毒目、管尾噬菌體科（Caudovirales，Siphovirida）。對ФEc53提取核酸后進行脈沖場電泳及瓊脂糖凝膠電泳，結果表明：該噬菌體的基因組大小為37.7kb左右，含EcoRⅠ、EcoRⅤ、BamHⅠ和NdeⅠ的多個酶切位點。通過SDS-PAGE對噬菌體蛋白進行分析表明，噬菌體顆粒至少含有8種衣殼蛋白，其中相對分子量為22kD的蛋白條帶含量較大，表明這種蛋白在噬菌體病毒顆粒中所占比例較高，可能為主要衣殼蛋白。 將噬菌體與宿主菌按照一定比例（分別為MOI=0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001）進行混合，37℃振蕩培養(yǎng)，每隔12min取出測定細菌濃度，確定最佳感染復數為0.01。選取最佳感染復數進行一步生長曲線的測定及繪制，噬菌體ФEc53感染宿主菌的潛伏期約為5min，根據爆發(fā)量=噬菌體爆發(fā)末期的噬菌體滴度/感染初期細菌的濃度的公式計算，爆發(fā)量為6.06×10~3PFU/cell，在50min時到達平臺期。 通過超濾的濃縮方法可提高噬菌體滴度，并降低內毒素含量。經宿主特異性及裂解范圍實驗表明，該噬菌體有高度的特異性，僅能裂解1株陰溝腸桿菌，為窄譜噬菌體。經過7個月的保存實驗證明：保存于4℃和-70℃中的噬菌體的滴度并未發(fā)生明顯變化。 噬菌體對皮下膿腫感染動物模型的治療實驗 建立家兔皮下膿腫感染模型，皮下注射陰溝腸桿菌53后，立即在相同部位皮下注射ФEc53，觀察并記錄膿腫情況，測定膿腫部位、肝臟及脾臟內的細菌數量及噬菌體滴度。結果表明，噬菌體治療組膿腫面積隨時間推移逐漸減小，膿腫內部細菌量有所下降的同時噬菌體量有所升高。 本實驗初步研究了ФEc53的生物學特性及其抗感染治療，為今后噬菌體的深入研究提供一些依據。
【關鍵詞】：陰溝腸桿菌 噬菌體 生物學特性 噬菌體治療
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 文獻回顧11-19
• 1.1 噬菌體的結構、抗菌機制及特點11-13
• 1.1.1 噬菌體的結構11
• 1.1.2 噬菌體的抗菌機制11-13
• 1.1.3 噬菌體的抗菌特點13
• 1.2 噬菌體的發(fā)現(xiàn)及初期研究13-14
• 1.3 二戰(zhàn)后東歐噬菌體研究發(fā)展14-15
• 1.4 西歐及美國地區(qū)腸桿菌科細菌的噬菌體研究進展15-17
• 1.4.1 大腸埃希菌噬菌體研究15-16
• 1.4.2 銅綠假單胞菌噬菌體研究16
• 1.4.3 其他腸道桿菌噬菌體的情況16-17
• 1.5 噬菌體研究的發(fā)展趨勢17-19
• 1.5.1 噬菌體基因結構的改造17
• 1.5.2 噬菌體基因編碼產物的開發(fā)與應用17-19
• 第2章 陰溝腸桿菌噬菌體的分離鑒定及生物學特性的研究19-39
• 2.1 材料與方法19-28
• 2.1.1 材料19-21
• 2.1.2 方法21-28
• 2.2 結果28-36
• 2.2.1 陰溝腸桿菌的 16S rRNA 鑒定28-29
• 2.2.2 陰溝腸桿菌噬菌體的分離及純化29
• 2.2.3 噬菌體的電鏡觀察29-30
• 2.2.4 噬菌體的核酸提取及酶切分析30-31
• 2.2.5 噬菌體蛋白的 SDS-PAGE 凝膠電泳31-33
• 2.2.6 最佳感染復數的測定33
• 2.2.7 一步生長曲線的繪制33-34
• 2.2.8 噬菌體的濃縮及內毒素的去除34
• 2.2.9 噬菌體的保存34-35
• 2.2.10 宿主菌的特異性判定和裂解譜實驗35-36
• 2.3 討論36-39
• 第3章 陰溝腸桿菌噬菌體抗感染的初步應用39-47
• 3.1 材料39-40
• 3.1.1 實驗菌株39
• 3.1.2 實驗用噬菌體39
• 3.1.3 實驗動物39-40
• 3.1.4 實驗器材40
• 3.2 方法40-42
• 3.2.1 制備菌懸液及測定菌液濃度40
• 3.2.2 制備噬菌體懸液及測定其滴度40
• 3.2.3 家兔皮下膿腫模型的建立40-41
• 3.2.4 噬菌體治療41-42
• 3.3 結果42-44
• 3.3.1 家兔皮下膿腫生長情況42-43
• 3.3.2 各組織內細菌濃度的測定43
• 3.3.3 各組織內噬菌體滴度的測定43-44
• 3.4 討論44-47
• 第4章 結論47-48
• 參考文獻48-54
• 作者簡介54-55
• 在學期間取得的科研成果55-56
• 致謝56

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 張立麗;李寧;趙秀英;;噬菌體治療研究進展[J];北京醫(yī)學;2011年03期

2 劉悅;李菁華;史紅艷;溫劍平;孫延波;;腸出血性大腸埃希菌O157噬菌體的生物學特性[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2012年01期

3 徐焰;噬菌體溶菌機制研究進展[J];重慶醫(yī)學;2003年01期

4 陳曉春,王繼文,曹永長,畢英佐,馬靜云;噬菌體在疾病治療方面的應用及研究[J];動物醫(yī)學進展;2005年01期

5 李耘;劉健;薛峰;張秀珍;胡云建;王桂蘭;褚云卓;胡志東;楊敬芳;趙旺勝;顧兵;胡必杰;俞云松;楊健;李艷;劉文恩;周玲;楊亞靜;府偉靈;徐修禮;裴鳳艷;楊濱;孟靈;季萍;郝鳳蘭;鐘巍;王琪;李曼寧;齊慧敏;;衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網(Mohnarin)2007-2008年報告[J];中國臨床藥理學雜志;2011年05期

6 鄭波;呂媛;;衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網2011年革蘭陽性菌耐藥監(jiān)測[J];中國臨床藥理學雜志;2012年12期

7 楊山虹;劉琪;梁培松;彭祖旺;胡文波;盧蘭芬;孫各琴;;196株陰溝腸桿菌對抗菌藥物的敏感性分析[J];檢驗醫(yī)學與臨床;2013年01期

8 錢震雯;岳啟安;田鳳麗;;噬菌體治療的研究概況[J];醫(yī)學綜述;2007年16期

9 李家泰,李耘,齊慧敏;2002—2003年中國革蘭陰性細菌耐藥性監(jiān)測研究[J];中華檢驗醫(yī)學雜志;2005年01期

10 李家泰,齊慧敏,李耘,中國細菌耐藥監(jiān)測研究組;2002—2003年中國醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染革蘭陽性細菌耐藥監(jiān)測研究[J];中華檢驗醫(yī)學雜志;2005年03期

中國碩士學位論文全文數據庫 前1條

1 孫榮華;大腸埃希菌噬菌體生物學特性及其抗感染初步研究[D];吉林大學;2009年

  本文關鍵詞：陰溝腸桿菌噬菌體的分離鑒定及生物學特性的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：307968