目的：利用畢赤酵母高效表達(dá)耐輻射奇球菌PprI蛋白，對pxxx/YYY畢赤酵母重組工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)，并對PprI蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和發(fā)酵條件進(jìn)行研究，并建立相應(yīng)的表達(dá)、純化和發(fā)酵技術(shù)路線，獲得大量的PprI蛋白，為進(jìn)一步研究PprI蛋白的作用機理及生物效應(yīng)提供實驗資料。材料與方法：構(gòu)建畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pxxx-His-pprI，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pxxx6×His-pprI經(jīng)Sal I酶切線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母YYY感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行篩選，挑取經(jīng)鑒定為陽性的pxxx-6×His pprI畢赤酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，加入甲醇至終濃度為1%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳，Western blotting，質(zhì)譜鑒定目的蛋白。采用離子交換、SFF（Ni）鎳鰲合親和層析、凝膠層析過濾和咪唑洗脫進(jìn)行蛋白純化，SDS-PAGE電泳檢測。采用Bradford法進(jìn)行His-PprI蛋白質(zhì)濃度測定。外源蛋白表達(dá)條件，誘導(dǎo)時間、補加甲醇濃度、溶氧、發(fā)酵液pH值等方面逐個進(jìn)行實驗優(yōu)化。用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)量，以蛋白含量高低及蛋白電泳條帶明暗為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)的OD值做出標(biāo)準(zhǔn)曲... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.雙酶切pCMV-HA-pprI質(zhì)粒的電泳檢查

第一部分 耐輻射球菌 PprI 蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)、發(fā)酵和純化技總體積為 100 μl將上述 PCR 反應(yīng)體系分裝為每管 20μl，加入模板 1 ul。混勻后進(jìn)行 PCPCR 反應(yīng)程序如下：94℃ 變性 5 min94℃ 變性 1 min50℃ 退火 1 min72℃ 延伸 2 min25 cycle72℃ 延伸 10 minPCR 反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物全部上樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢查。結(jié)果顯示，第 6、11 號轉(zhuǎn)化子可擴(kuò)增出 pprI 的特征性條帶，表明這 性重組克隆。

圖 3. pPIC9K-pprI 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清液的 SDS-PAGE 電泳構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體 pHBM-pprIHis-pprI 基因編碼序列的合成與密碼子優(yōu)化赤酵母密碼子的偏愛性對耐輻射奇球菌 R1（Deinococcus rAAF09762.1，Gene ID: 1798483）中的蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行的合成與 DNA 測序均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。物合成合成 pprI 基因的序列設(shè)計引物，在其上游引入 6×His 標(biāo)簽分別為：R-F:GTCACATCATCACCACCATCATGTTCCATCTGCTAACR-R: GGCCATTATTGGGCAGCATCTTGTGGTTCA


本文編號：3064511