發(fā)布時間：2017-04-14 17:04

  本文關鍵詞：大腸桿菌脂多糖刺激RAW264.7細胞條件下CD40的作用機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白細胞分化抗原40(Cluster of differentiation antigen40, CD40)是一種重要的共刺激分子,異常表達會引發(fā)自身免疫炎癥疾病。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)本質(zhì)上是一種糖蛋白,是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,可以引發(fā)損傷性炎癥反應,同時也是CD40基因表達的誘導物之一,可以上調(diào)RAW264.7細胞中CD40的表達。CD40的功能闡釋可能為治療炎癥性疾病提供了新思路。 RNA干擾(RNAinterference, RNAi)可以使基因表達沉默,是研究特定基因功能及基因治療的有力工具。本實驗擬應用小干擾RNA(Small interfering RNA, siRNA)抑制LPS刺激條件下CD40的表達,應用蛋白印跡(Western blot)技術檢測LPS刺激條件下siRNA對CD40表達的影響,應用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)、Western blot和Griess法分別檢測其對細胞因子的分泌、誘導型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)蛋白的表達及一氧化氮的產(chǎn)生(Nitric oxide, NO)的影響。結(jié)果表明,在LPS刺激條件下,siRNA能有效的抑制CD40的表達。LPS刺激條件下,通過siRNA轉(zhuǎn)染使CD40knockdown, RAW264.7細胞的白細胞介素-1β(Interleukin-1, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor alpha, TNF-a)和巨噬細胞炎癥蛋白-2(Macrophage inflammatory protein-2, MIP-2)的分泌減少,誘導型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)蛋白的表達下調(diào)并且NO的產(chǎn)生減少。這些研究結(jié)果為治療LPS介導的疾病提供了依據(jù)。
【關鍵詞】：白細胞分化抗原40 小干擾RNA 脂多糖 細胞因子
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 文獻綜述9-17
• 1 脂多糖9-11
• 2 白細胞分化抗原40(CD40)11-15
• 2.1 CD40的結(jié)構(gòu)及分布11
• 2.2 CD40在免疫反應中的作用11-13
• 2.3 CD40異常表達與疾病的發(fā)生發(fā)展13-15
• 3 RNA干擾15-17
• 3.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)及作用機制15-16
• 3.2 RNAi的應用16-17
• 第一部分 siRNA有效抑制LPS刺激條件下的RAW264.7細胞CD40的表達17-37
• 1 前言17-18
• 2 材料與方法18-32
• 2.1 實驗材料18-23
• 2.1.1 實驗細胞18
• 2.1.2 主要試劑18-19
• 2.1.3 主要儀器19
• 2.1.4 主要溶液配制方法19-23
• 2.2 實驗方法23-32
• 2.2.1 RAW264.7細胞的培養(yǎng)及LPS刺激23-25
• 2.2.2 RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染25-27
• 2.2.3 LPS刺激條件下siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞27
• 2.2.4 Western blot檢測CD40蛋白表達27-31
• 2.2.5 數(shù)據(jù)分析31-32
• 3 實驗結(jié)果32-35
• 3.1 未刺激和LPS刺激條件下RAW264.7細胞的形態(tài)觀察32-33
• 3.2 siRNA的轉(zhuǎn)染效率33
• 3.3 LPS刺激條件下siRNA knockdown RAW264.7細胞CD40蛋白的表達33-35
• 4 討論35-37
• 4.1 LPS刺激與RAW264.7細胞CD40的表達35
• 4.2 siRNA轉(zhuǎn)染35-37
• 第二部分 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞3 種細胞因子的分泌和產(chǎn)生NO的影響37-58
• 1 前言37-39
• 2 材料與方法39-42
• 2.1 實驗材料39
• 2.1.1 實驗細胞39
• 2.1.2 主要試劑39
• 2.1.3 主要儀器39
• 2.1.4 主要溶液配制方法39
• 2.2 實驗方法39-42
• 2.2.1 細胞上清的獲取39
• 2.2.2 ELISA法檢測細胞上清中的細胞炎癥因子39-40
• 2.2.3 Western blot檢測iNOS蛋白表達40-41
• 2.2.4 細胞上清中NO含量的檢測41
• 2.2.5 數(shù)據(jù)分析41-42
• 3 實驗結(jié)果42-55
• 3.1 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞分泌IL-1β的影響42-45
• 3.1.1 LPS刺激濃度分析42-43
• 3.1.2 LPS刺激時間分析43-44
• 3.1.3 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞分泌IL-1β的影響44-45
• 3.2 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響45-48
• 3.2.1 LPS刺激濃度分析45-46
• 3.2.2 LPS刺激時間分析46-47
• 3.2.3 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響47-48
• 3.3 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞分泌MIP-2的影響48-51
• 3.3.1 LPS刺激濃度分析48-49
• 3.3.2 LPS刺激時間分析49-50
• 3.3.3 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞分泌MIP-2的影響50-51
• 3.4 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞iNOS蛋白表達的影響51-52
• 3.5 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞產(chǎn)生NO的影響52-55
• 3.5.1 LPS刺激濃度分析52-53
• 3.5.2 LPS刺激時間分析53-54
• 3.5.3 LPS刺激條件下CD40 knockdown對RAW264.7細胞產(chǎn)生NO的影響54-55
• 4 討論55-58
• 4.1 炎癥細胞因子55-56
• 4.1.1 白細胞介素-1β55
• 4.1.2 腫瘤壞死因子α55-56
• 4.1.3 巨噬細胞炎癥蛋白256
• 4.2 NO56
• 4.3 LPS刺激條件的選擇56-58
• 全文結(jié)論58-59
• 參考文獻59-66
• 縮略語表66-69
• 致謝69

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4 李，

本文編號：306431