腫瘤壞死因子家族在維持免疫平衡,控制細胞死亡和炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用。這些細胞因子被腫瘤壞死因子受體家族的蛋白識別,激活信號轉(zhuǎn)導通路,形成死亡誘導的信號復合體（death inducing signalling complex, DISK）,促進細胞死亡。研究最為廣泛的腫瘤壞死因子受體包括TNFR1/2, FAS和DR4/DR5,它們分別識別TNFa, FAS配體和TRAIL。死亡結(jié)構(gòu)域所介導的自體或異體寡聚化對死亡誘導信號復合體的形成至關(guān)重要。它包括死亡受體自身或與其下游的接頭蛋白TRADD或FADD之間的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用而形成寡聚復合體。NleB是腸致病性大腸桿菌（enteropathogenic Escherichia coli, EPEC）三型分泌系統(tǒng)的效應蛋白,在前人的研究中被認為具有抑制NF-κB信號通路的作用。本論文從此生物學現(xiàn)象入手,發(fā)現(xiàn)無論在細胞轉(zhuǎn)染還是細菌感染水平,NleB都能非常有效地抑制腫瘤壞死因子（TNFa）激活的NF-κB炎癥反應,而對白細胞介素（IL-1p）激活的NF-κB信號通路毫無影響。我們綜合利用酵母雙雜交,免疫共沉淀等生化手段,找到了NleB... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：109 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
第一章 引言
    1.1 腸致病性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌的研究進展
        1.1.1 病原性大腸桿菌概述
        1.1.2 腸致病性大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌的研究進展
    1.2 三型分泌系統(tǒng)和效應蛋白
    1.3 腸致病性大腸桿菌的非LEE效應蛋白
    1.4 病原菌和宿主細胞之間的相互作用
        1.4.1 細菌效應蛋白對宿主細胞骨架系統(tǒng)的影響
        1.4.2 細菌效應蛋白對宿主泛素化系統(tǒng)的影響
        1.4.3 細菌效應蛋白對宿主NF-κB和MAPK信號通路的影響
    1.5 死亡受體信號通路
        1.5.1 死亡受體家族的成員
        1.5.2 死亡受體信號的傳導
第二章 材料方法
    2.1 分子生物學操作
        2.1.1 聚合酶鏈式反應
        2.1.2 限制性內(nèi)切酶酶切反應
        2.1.3 瓊脂糖凝膠電泳
        2.1.4 連接和轉(zhuǎn)化
        2.1.5 定點突變
        2.1.6 質(zhì)粒大提
        2.1.7 本論文中構(gòu)建的基因和質(zhì)粒總結(jié)
    2.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        2.2.1 細胞來源以及培養(yǎng)條件
        2.2.2 細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.3 穩(wěn)定細胞系的建立
        2.2.4 SiRNA轉(zhuǎn)染
    2.3 雙熒光素酶報告實驗
    2.4 免疫印跡、免疫共沉淀
        2.4.1 常用試劑配方
        2.4.2 免疫印跡
        2.4.3 免疫共沉淀
        2.4.4 本論文中使用的抗體總結(jié)
    2.5 p65蛋白的免疫熒光染色
    2.6 原核表達純化重組蛋白
        2.6.1 常用試劑配方
        2.6.2 重組蛋白His-Sumo-NleB及其突變體的純化
        2.6.3 重組蛋白GST-TRADD DD以及GST-FADD的純化
    2.7 酵母雙雜交實驗
        2.7.1 實驗中用到的培養(yǎng)基
        2.7.2 LiAc-介導的酵母轉(zhuǎn)化
        2.7.3 酵母雙雜交
        2.7.4 酵母DNA的提取
    2.8 腸致病性大腸桿菌的實驗操作
        2.8.1 腸致病性大腸桿菌的培養(yǎng)
        2.8.2 腸致病性大腸桿菌的活化和感染
    2.9 細胞死亡的檢測
第三章 實驗結(jié)果與分析
    3.1 NleB抑制宿主細胞NF-κB信號通路的激活具有選擇性
    3.2 NleB抑制多種TNF受體復合物下游的信號通路
    3.3 TRADD是NleB的結(jié)合蛋白
    3.4 NleB抑制TRADD DD寡聚進而抑制TNF受體復合物的組裝
        3.4.1 NleB抑制TRADD過表達所激活的NF-κB和細胞死亡信號通路
        3.4.2 NleB抑制TRADD過表達所引起的自體或異體寡聚
        3.4.3 NleB抑制刺激條件下TNF受體復合物的組裝
    3.5 極少量NleB即可以抑制TRADD DD自身寡聚以及與其他死亡受體結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合
    3.6 NleB是一個細菌效應蛋白家族的成員
    3.7 NleB在體外是一個N-乙酰葡萄糖胺單糖轉(zhuǎn)移酶
    3.8 NleB在體內(nèi)是一個N-乙酰葡萄糖胺單糖轉(zhuǎn)移酶
    3.9 NleB不是一個O-連接的N-乙酰葡萄糖胺單糖轉(zhuǎn)移酶
    3.10 TRADD DD中第235位的精氨酸是NleB的修飾位點
    3.11 TRADD DD中第235位的精氨酸對TRADD功能很重要
    3.12 NleB能修飾多個含保守修飾位點的死亡受體或其接頭蛋白
    3.13 NleB抑制多種死亡受體介導的細胞死亡
    3.14 細菌感染條件下NleB對死亡結(jié)構(gòu)域蛋白糖基化的分析
    3.15 細菌感染條件下NleB對死亡受體信號通路的抑制作用
        3.15.1 細菌感染條件下NleB對TNF受體信號通路的抑制作用
        3.15.2 細菌感染條件下NleB對其他受體信號通路的抑制作用
    3.16 NleB糖基轉(zhuǎn)移酶活性在動物感染模型中的研究
        3.16.1 鼠類檸檬酸桿菌中NleBc的生物學活性
        3.16.2 小鼠感染腸道定殖模型中NleB家族酶活功能的研究
第四章 討論與展望
    4.1 實驗結(jié)論
    4.2 討論和展望
        4.2.1 關(guān)于精氨酸修飾的討論
        4.2.2 關(guān)于課題意義的討論和展望
參考文獻
致謝
個人簡歷



本文編號：3036140