本文關(guān)鍵詞：卵巢癌相關(guān)抗原CA125的原核表達(dá)、純化及其抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：CA125是由Bast[1]等于1983年發(fā)現(xiàn)并命名，其血清學(xué)水平在卵巢癌等惡性腫瘤病人異常升高。CA125自發(fā)現(xiàn)以來一直作為卵巢癌常規(guī)篩查、輔助診斷及療效評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物[2]。目前臨床檢測及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究等所用CA125抗體大多是依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴，檢測成本高，限制其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，建立快速、高效、經(jīng)濟(jì)的制備CA125抗體的方法，對CA125試劑盒開發(fā)及相關(guān)基礎(chǔ)研究都具有重要的意義。 目的： 1.建立快速高效經(jīng)濟(jì)的CA125串聯(lián)重復(fù)序列（CA125R）原核表達(dá)系統(tǒng)，，表達(dá)、分離純化CA125R蛋白并鑒定。 2.制備兔抗CA125R蛋白的抗血清，分離純化多克隆抗體并鑒定其識(shí)別天然CA125蛋白的特異性。 3.制備鼠抗CA125R蛋白的單克隆抗體，并鑒定其識(shí)別天然CA125糖蛋白的特異性。 方法： 1.全基因合成一段CA125串聯(lián)重復(fù)序列（CA125R），并將此片段連接至pGEX-6P-1及pET-32a(+)原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX/CA125R及pET/CA125R。 2.分別將pGEX/CA125R和pET/CA125R轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），確定最佳表達(dá)條件后，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，分別經(jīng)GST親和層析和鎳離子親和層析系統(tǒng)分離純化重組蛋白，并鑒定所純化的重組蛋白。 3.將純化的重組CA125R蛋白免疫新西蘭大白兔，制備抗血清，經(jīng)蛋白A抗體純化系統(tǒng)分離純化多克隆抗體，并鑒定。 4.將純化的重組CA125R蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選陽性克隆，并進(jìn)一步克隆化，建立穩(wěn)定分泌抗CA125單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系，采用小鼠腹水誘生法大量制備單克隆抗體，制備的抗體經(jīng)蛋白A純化系統(tǒng)純化并鑒定。 結(jié)果： 1.經(jīng)基因重組技術(shù)，成功建立CA125R原核表達(dá)系統(tǒng)，分別通過GST親和層析及鎳離子親和層析系統(tǒng)分離純化得到GST-CA125R和TRAX-CA125R重組蛋白。 2.將純化的TRAX-CA125R重組蛋白免疫家兔，制備其抗血清，并經(jīng)純化得到其多克隆抗體，多克隆抗體經(jīng)Western blot驗(yàn)證能特異識(shí)別天然CA125糖蛋白，具有應(yīng)用價(jià)值。 3.將純化的GST-CA125R重組蛋白免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，將免疫的小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，成功獲得一株穩(wěn)定分泌抗CA125單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)腹水誘生及純化獲得高純度的抗CA125單克隆抗體。 結(jié)論： 采用基因重組技術(shù)，成功建立快速經(jīng)濟(jì)高效的重組CA125R原核表達(dá)系統(tǒng)，純化獲得了高純度的重組CA15R蛋白；以純化的TRAX-CA125R蛋白為免疫原，制備了兔抗CA125多克隆抗體，制備的抗體能特異識(shí)別天然CA125糖蛋白；以GST-CA125R蛋白為免疫原，成功獲得一株穩(wěn)定分泌抗CA125單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備了高純度的單克隆抗體，為以后的相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床試劑盒開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：CA125 原核表達(dá) 多克隆抗體 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R737.31;R392
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 第一部分 CA125 串聯(lián)重復(fù)序列的原核表達(dá)、純化及鑒定16-35
• 1 材料與方法16-28
• 2 結(jié)果28-32
• 3 討論32-34
• 4 小結(jié)34-35
• 第二部分 CA125 抗體制備、純化及鑒定35-48
• 1 材料與方法35-40
• 2 結(jié)果40-45
• 3 討論45-47
• 4 小結(jié)47-48
• 全文總結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-51
• 文獻(xiàn)綜述51-61
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 致謝61-62
• 攻讀學(xué)位期間撰寫和發(fā)表的學(xué)術(shù)論文62-63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 梁勤東;馬婷婷;董晉豫;李武縣;汪先桃;李紫微;王秦;熊海玉;涂植光;;卵巢癌相關(guān)抗原CA125單克隆抗體的制備[J];中國生物制品學(xué)雜志;2013年10期

2 秦蘭霞,徐德昌,王榮春;大腸桿菌異源重組蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性[J];生物信息學(xué);2005年03期

3 王開友;張魯平;王穎;潘琪;;血管內(nèi)皮生長因子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的影響[J];中國矯形外科雜志;2007年19期

4 白飛虎;李來生;郭新寧;楊力;翟惠虹;聶勇戰(zhàn);王鈞;吳開春;樊代明;;胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性[J];腫瘤防治研究;2006年03期

5 梁勤東;郭變琴;汪仙桃;李武縣;董晉豫;王秦;涂植光;;卵巢癌相關(guān)抗原CA125串聯(lián)重復(fù)序列的原核表達(dá)純化及抗血清制備[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2012年11期

  本文關(guān)鍵詞：卵巢癌相關(guān)抗原CA125的原核表達(dá)、純化及其抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：303296