發(fā)布時間：2017-04-13 08:05

  本文關鍵詞：人體細胞體外重編程為誘導性多能干細胞關鍵技術的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究將攜帶胚胎特異性轉錄因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒顆粒感染人包皮成纖維細胞（human postnatal foreskin fibroblasts hPFF），體外重編程為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell iPSC）；原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVE）體系,將表達microRNA-302-367基因慢病毒顆粒感染HUVE，探討目的基因microRNA-302-367過表達慢病毒顆粒感染HUVE體外重編程為誘導性多能干細胞（inducedpluripotent stem cell iPSC）的關鍵技術。 方法（1）以最佳病毒感染復數(shù)（Multiplicity of infection，MOI值）感染hPFF,體外重編程為iPSC，通過細胞形態(tài)學、堿性磷酸酶染色進行驗證及畸胎瘤成瘤實驗對iPSC多向分化潛能進行鑒定（2）采用0.1%Ⅰ型膠原酶灌注人臍靜脈，消化15min后收集人臍靜脈內(nèi)皮細胞懸液，接種于T25cm的培養(yǎng)瓶中，進行培養(yǎng)。以免疫細胞化學法進行細胞鑒定；MTS法測定細胞生長曲線。（3）將過表達綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的空病毒顆粒感染HUVE，在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達情況，探討最佳感染條件及MOI值；（4）將生長狀態(tài)良好的HUVE隨機分為3組：正常對照組、含綠色熒光蛋白空病毒載體感染組、目的基因感染組進行感染，第2天給予干細胞培養(yǎng)條件,在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)變化，探討最佳培養(yǎng)條件。 結果（1）在最佳MOI值40的慢病毒感染條件下感染hPFF,感染7天后，細胞偽足收縮，形態(tài)由長梭形變?yōu)閳A形，感染25天后，可挑選細胞克�。粔A性磷酸酶染色為陽性；畸胎瘤成瘤實驗證實iPSC具有向內(nèi)、中、外三個胚層分化的潛能（2）0.1%Ⅰ型膠原酶消化人臍靜脈體外建立穩(wěn)定的HUVE系，，培養(yǎng)3天后，0.25%胰蛋白酶消化傳代。免疫細胞化學法SABC法鑒定HUVE細胞第VIII因子相關抗原呈陽性結果。(3)本實驗室培養(yǎng)條件下，慢病毒感染HUVE的最佳MOI值為10，經(jīng)PCR檢測microRNA-302-367過表達慢病毒顆粒能有效感染HUVE。 結論本研究成功地將hPFF體外重編程為iPSC；本研究于體外建立穩(wěn)定的HUVE系；慢病毒顆粒可有效地感染hPFF、HUVE。
【關鍵詞】：人包皮成纖維細胞 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 慢病毒 重編程 誘導性多能干細胞
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 中英文簡寫對照5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-13
• 第一部分 人包皮成纖維細胞體外誘導為多能干細胞13-21
• 一、實驗目的13
• 二、實驗材料13-14
• 三、實驗方法14-17
• 四、實驗結果17-19
• 五、 討論19-21
• 第二部分 人臍靜脈內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)及體外誘導為多能干細胞的實驗研究21-36
• 第一章 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)21-27
• 一、實驗目的21
• 二、實驗材料21-22
• 三、實驗方法22-24
• 四、實驗結果24-26
• 五、討論26-27
• 第二章 人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外誘導為多能干細胞的實驗研究27-36
• 第一節(jié) 表達綠色熒光蛋白基因的慢病毒顆粒感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞的實驗研究27-32
• 一、實驗目的27
• 二、實驗材料27
• 三、實驗方法27-28
• 四、實驗結果28-30
• 五、討論30-32
• 第二節(jié) microRNA(miR-302-367）慢病毒顆粒感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞的實驗研究32-36
• 一、實驗目的32
• 二、實驗材料32
• 三、實驗方法32-33
• 四、實驗結果33-34
• 五、討論34-36
• 結論36-37
• 參考文獻37-41
• 致謝41-42
• 綜述42-50
• 參考文獻47-50

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