本文關(guān)鍵詞：重組人白細胞介素-7及其剪接變異體蛋白的表達、復性和純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白細胞介素-7（interleukin-7，IL-7）是一種多潛能的細胞因子，能促進B和T淋巴細胞生存、分化和增殖，在T細胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，且能誘導CTL和巨噬細胞的細胞毒活性，因此，IL-7對T細胞耗竭的病人（如癌癥、骨髓移植及AIDS）有非常好的治療潛能。近年來人們在不同的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了分子大小不同的IL-7剪接變異體（如IL-7-δ4、IL-7-δ4/5、IL-7-δ3/4等），推測其可能參與調(diào)節(jié)IL-7的生物活性。因此，本課題利用原核表達系統(tǒng)表達、復性和純化重組人IL-7（recombinanthuman IL-7，rhIL-7）及其剪接變異體蛋白（rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4），并利用免疫印跡技術(shù)對其進行鑒定，為其生物活性研究打下基礎(chǔ)。 研究目的： 本課題在已經(jīng)成功構(gòu)建IL-7及其剪接變異體的原核表達載體pET21b-IL-7、pET21b-IL-7-δ4、pET21b-IL-7-δ4/5和pET21b-IL-7-δ3/4的基礎(chǔ)上，表達、復性和純化rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5和rhIL-7-δ3/4蛋白，為其生物活性研究打下基礎(chǔ)。 研究方法： ⒈rhIL-7及其剪接變異體蛋白的表達：對各保種菌重新進行PCR鑒定和測序鑒定后，測定生長曲線，以確定最佳IPTG誘導時機，并對各重組蛋白進行誘導表達和可溶性分析，優(yōu)化IPTG誘導濃度和誘導時間，以確定最佳表達參數(shù)，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物。 ⒉rhIL-7及其剪接變異體蛋白的復性：各重組蛋白以包涵體形式表達后，通過梯度透析的方法復性，復性液A、B、C、D、E中分別含4、3、2、1、0M鹽酸胍（Gu-HCl），并在復性關(guān)鍵步驟中加入L-精氨酸（L-Arg）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和還原型谷胱甘肽（GSH）等復性輔助試劑以提高復性效率，采用BCA法測定蛋白液復性前后的濃度以計算各蛋白的復性效率。 ⒊rhIL-7及其剪接變異體蛋白的純化和Western Blot鑒定：采用Ni2+親和層析色譜法純化各重組蛋白，上樣后經(jīng)Binding Buffer（30mM咪唑）洗脫非特異性結(jié)合的雜蛋白，再分別用Elution BufferA（60mM咪唑）、B（100mM咪唑）、C（300mM咪唑）進行梯度洗脫，分階段收集洗脫液，SDS-PAGE、BandScan軟件分析各蛋白純度，BCA法測定純化后的各蛋白濃度。分別以6×His小鼠單克隆抗體和鼠抗人IL-7抗體為一抗，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG為二抗對純化后的各重組蛋白進行Western Blot鑒定。 結(jié)果： ⒈rhIL-7及其剪接變異體蛋白的表達：PCR擴增出的片段大小與預(yù)期的IL-7（531bp）、IL-7-δ4（399bp）、IL-7-δ4/5（345bp）、IL-7-δ3/4（318bp）一致，且測序結(jié)果與已報道的序列一致。rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白均能在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得良好表達，分別在17.4kDa、12.4kDa、10.3kDa、9.3kDa附近有一明顯的條帶，且均為包涵體形式表達。生長曲線分析和表達條件優(yōu)化結(jié)果顯示，rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白最佳誘導時機分別為：37℃、180rpm培養(yǎng)1.5h、2h、2.3h、1.8h；其最佳表達條件分別為（37℃、180rpm條件下培養(yǎng)）：1.0mM IPTG誘導2h、0.4mM IPTG誘導2h、0.6mM IPTG誘導3h、0.8mM IPTG誘導2h。 ⒉rhIL-7及其剪接變異體蛋白的復性：rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白的復性效率均較好，分別約為50%、48%、45%、65%，，且該復性方法重復性良好，可用于各重組蛋白的大量制備。 ⒊rhIL-7及其剪接變異體蛋白的純化和Western Blot鑒定：SDS-PAGE、BandScan軟件分析顯示，各重組蛋白的純化效果較好，其純度均達到了95%以上，BCA法測定其純化后的濃度均約為0.1mg/mL。以6×His小鼠單克隆抗體為一抗的Western Blot鑒定結(jié)果顯示，rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4分別在17.4kDa、12.4kDa、10.3kDa、9.3kDa附近出現(xiàn)條帶；以鼠抗人IL-7抗體為一抗的Western Blot鑒定結(jié)果顯示，rhIL-7、rhIL-7-δ4分別在17.4kDa、12.4kDa附近出現(xiàn)條帶，而rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4分別在10.3kDa、9.3kDa處沒有條帶；Western Blot鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，表明各重組蛋白均獲得有效表達。 結(jié)論： 本研究采用原核表達系統(tǒng)表達rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白，確定了最佳表達參數(shù)；經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，各重組蛋白均為包涵體形式表達，經(jīng)梯度透析法復性后，各重組蛋白的復性效率均較好，分別約為50%、48%、45%、65%；采用Ni2+親和層析色譜法純化后，各重組蛋白的純化效果較好，其純度均達到了95%以上，BCA法測定其純化后的濃度均約為0.1mg/mL；經(jīng)Western Blot鑒定結(jié)果顯示，各重組蛋白均獲得有效表達。因此，成功獲得了高純度的rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4復性蛋白，且該技術(shù)方法穩(wěn)定性較好，有利于各重組蛋白的大量制備，為其生物活性研究打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：白細胞介素-7 剪接變異體 表達 復性 純化
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 第一章 序言13-19
• 1.1 研究背景13-18
• 1.1.1 IL-7 的結(jié)構(gòu)及來源13
• 1.1.2 IL-7 受體13
• 1.1.3 IL-7 的生物學活性13-14
• 1.1.4 IL-7 的應(yīng)用前景14-16
• 1.1.5 IL-7 剪接變異體16-18
• 1.2 研究路線18-19
• 第二章 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的表達19-33
• 2.1 前言19
• 2.2 實驗材料19-22
• 2.2.1 菌株和質(zhì)粒19
• 2.2.2 主要試劑19
• 2.2.3 引物19
• 2.2.4 主要溶液配制19-22
• 2.2.5 主要儀器設(shè)備22
• 2.3 實驗方法22-25
• 2.3.1 各重組原核表達質(zhì)粒的鑒定22-23
• 2.3.2 各保種菌的生長曲線測定23
• 2.3.3 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的誘導表達和可溶性分析23-24
• 2.3.4 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的表達條件優(yōu)化24-25
• 2.4 實驗結(jié)果25-32
• 2.4.1 各重組原核表達質(zhì)粒的鑒定25
• 2.4.2 各保種菌的生長曲線分析25-26
• 2.4.3 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的誘導表達和可溶性分析26-28
• 2.4.4 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的 IPTG 誘導濃度優(yōu)化28-30
• 2.4.5 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的 IPTG 誘導時間優(yōu)化30-32
• 2.5 討論32-33
• 第三章 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的復性33-40
• 3.1 前言33
• 3.2 實驗材料33-37
• 3.2.1 主要試劑33
• 3.2.2 主要溶液配制33-37
• 3.2.3 主要儀器設(shè)備37
• 3.3 實驗方法37-38
• 3.3.1 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白包涵體的洗滌和溶解37
• 3.3.2 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白包涵體的稀釋37-38
• 3.3.3 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白包涵體的復性38
• 3.4 實驗結(jié)果38-39
• 3.4.1 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白包涵體的復性效率38-39
• 3.5 討論39-40
• 第四章 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的純化和 Western Blot 鑒定40-47
• 4.1 前言40
• 4.2 實驗材料40-42
• 4.2.1 主要試劑40
• 4.2.2 主要溶液配制40-42
• 4.2.3 主要儀器設(shè)備42
• 4.3 實驗方法42-43
• 4.3.1 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的純化42
• 4.3.2 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的脫鹽和保存42
• 4.3.3 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的 Western Blot 鑒定42-43
• 4.4 實驗結(jié)果43-45
• 4.4.1 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的純化43-44
• 4.4.2 rhIL-7 及其剪接變異體蛋白的 Western Blot 鑒定44-45
• 4.5 討論45-47
• 全文總結(jié)47-48
• 研究展望48-49
• 參考文獻49-57
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文57-58
• 附錄 1 英文縮寫語中文對照58-60
• 致謝60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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  本文關(guān)鍵詞：重組人白細胞介素-7及其剪接變異體蛋白的表達、復性和純化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：302769