本文關(guān)鍵詞：粉塵螨HSP60的基因克隆、表達及免疫學(xué)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前，過敏性疾病已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。塵螨廣泛存在于人類居室環(huán)境的塵埃中，它作為一種重要的變應(yīng)原在變態(tài)反應(yīng)學(xué)研究中受到高度重視。塵螨可引起支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等多種變態(tài)反應(yīng)性疾病，嚴重影響人類健康。而塵螨中包含的引起變態(tài)反應(yīng)的成分-塵螨變應(yīng)原在研究中一直受到高度關(guān)注。并且，隨著探索的深入,不斷有新的塵螨變應(yīng)原被識別和發(fā)現(xiàn)，這極大地加深了人類對塵螨變應(yīng)原的認識，推動了塵螨過敏性疾病診斷、預(yù)防和治療的進步。通常寄生蟲的HSPs作為一種蛋白質(zhì)有較好的免疫原性，一方面，有誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)，成為粉塵螨變應(yīng)原的潛在可能；另一方面，有作為抗原用于塵螨過敏性疾病特異性免疫預(yù)防和治療的潛力。因此，本課題組在既往研究的基礎(chǔ)上，選擇粉塵螨熱休克蛋白60（Heat shock protein60，Hsp60）為研究對象，以期探索和發(fā)現(xiàn)粉塵螨新的變應(yīng)原組分，并對其免疫學(xué)特性進行初步研究。 研究目的： 以粉塵螨Hsp60為研究對象，測定和分析它的cDNA序列，，克隆表達出高純度的Hsp60蛋白片段，用重組蛋白與塵螨過敏病人血清反應(yīng)，對該蛋白是否可能是變應(yīng)原進行初步評估。 研究方法： 1、粉塵螨總RNA的提取用Trizol提取總RNA。 2、粉塵螨cDNA的合成及PCR擴增以提取的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)與塵螨相近物種Hsp60蛋白的特征性和保守序列設(shè)計簡并性引物，以cDNA為模板PCR擴增Hsp60基因片段。 3、測序及氨基酸序列分析將擴增獲得的PCR產(chǎn)物進行測序，將測序后堿基序列編碼的氨基酸序列進行同源性分析，并對氨基酸序列進行親水性區(qū)域分析。 4、粉塵螨Hsp60基因片段的擴增和TA克隆根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計特異性引物，并加入酶切位點，PCR擴增Hsp60基因片段，然后連接到PMD18-T載體上，并將陽性重組質(zhì)粒送公司測序。 5、粉塵螨Hsp60基因片段亞克隆將TA克隆質(zhì)粒和pET-32a(+)質(zhì)粒分別雙酶切，然后將目的基因片段連接在pET-32a(+)上，構(gòu)建pET-32a(+)-Hsp60原核表達載體。 6、重組蛋白的表達與純化將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達系統(tǒng)進行誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察表達情況，并進行可溶性分析。將表達的重組蛋白經(jīng)Ni-NTA層析柱純化。 7、重組蛋白Western blot鑒定以塵螨過敏病人血清為一抗與純化的重組蛋白反應(yīng)，以羊抗人IgE-HRP為二抗，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯示W(wǎng)estern blot結(jié)果。 8、重組蛋白質(zhì)譜分析將純化的重組蛋白SDS-PAGE電泳條帶切下后送公司做蛋白質(zhì)譜檢測。 研究結(jié)果： 1、提取粉塵螨的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用簡并引物成功擴增出約520bp大小的PCR產(chǎn)物。測序結(jié)果顯示其堿基序列與Achromobacter Xylosoxidans Hsp60相似度為86%，其堿基編碼的氨基酸與Advenella Mimigardefordensis Hsp60相似度可達92%。 2、成功的構(gòu)建了原核表達載體pET-32a(+)-Hsp60，并表達出大小為37KD左右的重組蛋白，經(jīng)Ni-NTA層析柱純化后獲得純度較高的可溶性目的蛋白。 3、純化的重組蛋白經(jīng)Western blot鑒定，能與塵螨過敏病人血清中的IgE反應(yīng)。 4、質(zhì)譜分析結(jié)果顯示：重組蛋白為Hsp60。 結(jié)論： 1、結(jié)合免疫印跡、蛋白組學(xué)分析技術(shù)對塵螨新變應(yīng)原進行分析和篩選是一種有效的方法，為新的塵螨變應(yīng)原的發(fā)現(xiàn)提供了一種新的技術(shù)線路。 2、本研究通過簡并引物PCR和基因測序方法首次確定了粉塵螨Hsp60部分cDNA序列。 3、通過基因克隆和大腸桿菌原核表達技術(shù)成功表達出粉塵螨Hsp60（片段）重組蛋白。且它能與粉塵螨過敏患者血清的IgE發(fā)生特異性結(jié)合，從而獲得了Hsp60可作為粉塵螨變應(yīng)原的重要證據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：粉塵螨 Hsp60 分析
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文縮略語11-12
• 技術(shù)路線12-13
• 前言13-16
• 材料和方法16-32
• 結(jié)果32-43
• 討論43-48
• 小結(jié)48-49
• 參考文獻49-53
• 綜述：塵螨變應(yīng)原的研究進展53-60
• 參考文獻56-60
• 在讀期間論文發(fā)表情況60-61
• 致謝61-62

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：粉塵螨HSP60的基因克隆、表達及免疫學(xué)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：302397