目的:培養(yǎng)人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞,建立人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型。方法:采用酶消化及聯(lián)合磁珠分選法,得到人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HDMECs）,體外培養(yǎng)傳至P5代,采用Ⅷ因子免疫熒光及CD309、CD34流式細(xì)胞學(xué)進(jìn)行鑒定。用缺氧Buffer加低氧艙的方法低氧處理P5代HDMECS。實驗分為四組,Con組不做任何處理、H8組低氧8小時組,H8R12組低氧8小時復(fù)氧12小時組、H8R24組低氧8小時復(fù)氧24小時組。TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）染色法檢測細(xì)胞凋亡,蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白的表達(dá)。結(jié)果:聯(lián)合法分離的細(xì)胞,經(jīng)過2次CD31磁珠分選后,可見細(xì)胞短梭形,呈鋪路石樣。細(xì)胞傳至P5,Ⅷ因子免疫熒光染色陽性率為（95±2.61）%。流式細(xì)胞儀檢測CD309陽性率為（95.4±1.34）%;CD34陽性率為（42.5±3.23）%。TUNEL染色、Western Blot結(jié)果顯示:H8組的細(xì)胞凋亡率和活化的Caspase-3表達(dá)高于Con組（P<0.05）,H8R12組、H8R2... 

【文章來源】：心肺血管病雜志. 2015,34(02)

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人皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)A:細(xì)胞生長4天

統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1．皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離及鑒定:細(xì)胞分離培養(yǎng)4天后，可見散在的細(xì)胞集落(圖1A)，周邊有成纖維狀細(xì)胞生長，細(xì)胞集落生長7天后，可見細(xì)胞呈鋪路石樣排列(圖1B);此時，細(xì)胞經(jīng)第1次磁珠分選，體外培養(yǎng)2天，可見細(xì)胞呈多角形或拖尾短梭狀生長(圖1C);體外培養(yǎng)4天后，經(jīng)第2次分選，可見細(xì)胞呈緊密排列的漩窩狀或同心圓狀外觀，呈鋪路石樣排列(圖1D)。2．免疫熒光:第1次磁珠分選后，隨機(jī)計算4個高倍鏡下Ⅷ因子免疫熒光染色陽性細(xì)胞率，陽性率為(45.3±5.2)%。第二次磁珠分選后陽性率＞95%(圖2)。圖3HDMECS流式鑒定結(jié)果A:CD309PE標(biāo)記檢測結(jié)果;B:CD34FITC標(biāo)記檢測結(jié)果3．CD309、CD34流式鑒定:流式細(xì)胞鑒定結(jié)果:CD309陽性率為(95.4±1.34)%;CD34陽性率為(42.5±3.23)%(圖3)。4．TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果:Con組陽性率為(3±1.2)%，H8組陽性率為(7.2±1.8)%，H8Ｒ12組陽性率為(15.3±1.3)%，H8Ｒ24組陽性率為(16.5±2)%。低氧使細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，H8組與Con組比較凋亡增高(P＜0.05);復(fù)氧增加細(xì)胞損傷，H8Ｒ12組、H8Ｒ24組陽性率與H8組比較增加更明顯(P＜0.05，圖4)。5．WesternBlot檢測活化的Caspase-3蛋白的表達(dá)結(jié)果未活化的caspase-3的條帶在32kDa附近;活化的caspase-3條帶在17kDa附近。H8組活化的Caspase-3表達(dá)明顯高于Con組(P=0.025)。H8Ｒ12組、H8Ｒ24組活化的Caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于H8組(P＜0.05，圖5)。134心肺血管病雜志2015年2月第34卷第2期JournalofCardiovascular＆PulmonaryDiseases，F(xiàn)ebruary2015，Vol．34，No．2

圖4低氧復(fù)氧增加內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡A:TUNEL染色為綠色，DAPI染色為藍(lán)色。B:TUNEL染色陽性細(xì)胞所占的比例，注:均與H8組比較，P＜0.05圖5Caspase-3WesternBlot檢測結(jié)果A:各組Caspase-3蛋白條帶結(jié)果，B:活化的Capase-3WesternBlot灰度值結(jié)果，注:均與H8組比較，P＜0.05討論隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展，游離皮瓣的運用越來越多，但出現(xiàn)的問題是，不能保證皮瓣較高的成活率。其中主要的原因是進(jìn)一步皮瓣恢復(fù)血流后，再灌注反而加重皮瓣的損傷。以往研究認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞在再灌注損傷中不僅僅是起著屏障作用，而且還協(xié)調(diào)著多形核細(xì)胞的轉(zhuǎn)運［4］，在機(jī)體的缺血低氧及炎癥等病理生理過程中起著重要的作用［5］。因此，建立HDMECs低氧/復(fù)氧模型對未來人皮瓣再灌注損傷機(jī)制的研究是非常迫切的。目前國內(nèi)外對于皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究較少，未見關(guān)于酶消化聯(lián)合磁珠分選培養(yǎng)HDMECs的研究。在國外皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取和培養(yǎng)的方法僅見于小鼠，方法包括磁珠分選［6］和密度梯度離心［7］的方法，國內(nèi)僅有胡大海等［8］采用胰酶和中性蛋白酶消化的方法對HDMECs的分離培養(yǎng)進(jìn)行了報道。本研究首次采用Dispase酶Ⅱ以及膠原酶Ⅰ消化聯(lián)合2次磁珠分選的方法提取培養(yǎng)人皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞。顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長特點具有內(nèi)皮細(xì)胞的生長特征［8］，Ⅷ因子免疫熒光鑒定陽性率＞95%，流式細(xì)胞學(xué)檢測CD309陽性率為(95.4±1.34)%;CD34陽性率為(42.5±3.23)%。本研究檢測了部分HDMECS生物學(xué)特性，能為我們今后HDMECS培養(yǎng)的研究奠定基矗目前國內(nèi)外用于細(xì)胞低氧的方法主要有缺氧Buffer和低氧艙兩種辦法。但是未有文獻(xiàn)評價各自優(yōu)缺點，而我們的研究采用缺氧Buffer加三氣培養(yǎng)箱低氧環(huán)境對HDMECs進(jìn)行低氧處理，是因為缺氧Buffer能讓細(xì)胞

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3003737