戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是導(dǎo)致急性戊肝的主要原因.通過(guò)建立基因IV型HEV感染A549細(xì)胞模型,研究病毒感染后TLR3信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的變化.病毒感染A549細(xì)胞后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IFN-β的mRNA表達(dá)量,Western blot分析磷酸化IRF3（pIRF3）和IKKε蛋白表達(dá)水平的變化.結(jié)果表明:HEV感染A549細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)IFN-β的相對(duì)表達(dá)水平顯著下降,TLR3信號(hào)通路介導(dǎo)的pIRF3及IKKε蛋白在病毒感染后表達(dá)量顯著下降.基因Ⅳ型HEV能夠抑制TLR3信號(hào)通路介導(dǎo)的IRF3的磷酸化及IKKε蛋白的表達(dá),從而抑制了IFN-β的表達(dá),為進(jìn)一步研究HEV復(fù)制機(jī)制和致病機(jī)理奠定基礎(chǔ). 

【文章來(lái)源】：昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2019,44(05)北大核心

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)．IFN－βmRNA在表明HEV抑制IFN－β的產(chǎn)生．素［11］．利中病毒拷染時(shí)間增長(zhǎng)而增加(見(jiàn)

(I∶C)處理6h后轉(zhuǎn)染ORF3組，72h細(xì)胞活性無(wú)顯著下降(見(jiàn)圖1)．2.2HEV感染后抑制IFN－β的表達(dá)IFN－I的表達(dá)是宿主抗病毒感染的重要防御因素［11］．利用RT－qPCR檢測(cè)HEV感染不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清中病毒拷貝數(shù)及IFN－β的表達(dá)．結(jié)果顯示，HEV拷貝數(shù)隨感染時(shí)間增長(zhǎng)而增加(見(jiàn)圖2(a))．IFN－βmRNA在HEV感染后被顯著抑制(P＜0.001)(見(jiàn)圖2(b))．表明HEV抑制IFN－β的產(chǎn)生．(a)HEV拷貝數(shù)(b)IFN－βmRNA表達(dá)水平圖2RT－qPCR檢測(cè)HEV拷貝數(shù)和IFN－βmRNA表達(dá)水平的變化Fig.2HEVRNAcopynumber(a)andIFN－βmRNAexpression(b)detectedbyRT－qPCR2.3HEV感染抑制IRF3磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3激活后會(huì)誘導(dǎo)IFN－I表達(dá)，對(duì)抗病毒感染具有重要作用［12］．為了進(jìn)一步探究IFN－β在HEV感染后期表達(dá)顯著降低的原因，我們通過(guò)Westernblot法檢測(cè)pIRF3蛋白在48h和72h的表達(dá)水27昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)第44卷??????????????????????????????????????????????

平．用Poly(I∶C)刺激A549細(xì)胞6h后，接種HEV或過(guò)表達(dá)HEVORF3，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(MOCK)和單純Poly(I∶C)處理組．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Poly(I∶C)能夠顯著刺激pIRF3的表達(dá);HEV感染組在48h和72h均顯著抑制pIRF3的表達(dá);進(jìn)一步證明過(guò)表達(dá)HEVORF3后，也能達(dá)到顯著抑制pIRF3蛋白表達(dá)的效果，說(shuō)明HEV抑制pIRF3是通過(guò)ORF3發(fā)揮作用(見(jiàn)圖3)．圖3Westernblot檢測(cè)HEV感染后pIRF3蛋白水平的變化Fig.3TheexpressionofpIRF3inHEV－infectedA549cells48hand72hpost－infectionanalyzedbyWesternblot2.4HEV感染抑制IKKε的表達(dá)TLR3通路中IKKε和TBK1結(jié)合能夠使IRF3磷酸化，從而誘導(dǎo)IFN－I的生成．為了探究HEV感染后期pIRF3蛋白表達(dá)降低的原因，我們驗(yàn)證了IKKε蛋白表達(dá)的變化．通過(guò)Westernblot檢測(cè)IKKε蛋白在48h和72h的表達(dá)水平．用Poly(I∶C)刺激A549細(xì)胞6h后，接種HEV或過(guò)表達(dá)HEVORF3，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(Mock)和單純Poly(I∶C)處理組．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單純Poly(I∶C)處理組相比HEV感染組在48h和72h均能顯著抑制IKKε蛋白的表達(dá);HEVORF3蛋白在72h也能顯著抑制IKKε蛋白的表達(dá)(見(jiàn)圖4)．說(shuō)明在HEV感染后通過(guò)抑制IKKε的表達(dá)，進(jìn)而抑制IRF3的磷酸化．2.5HEV感染后A549細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)病毒感染機(jī)體后，宿主免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生大量具有抗病毒作用的炎癥因子，如IL6和IL8．為了進(jìn)一步驗(yàn)證HEV感染后細(xì)胞內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平的變化，我們用RT－qPCR檢測(cè)HEV感染A549


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