戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是導致急性戊肝的主要原因.通過建立基因IV型HEV感染A549細胞模型,研究病毒感染后TLR3信號通路相關因子表達的變化.病毒感染A549細胞后通過實時熒光定量PCR檢測IFN-β的mRNA表達量,Western blot分析磷酸化IRF3（pIRF3）和IKKε蛋白表達水平的變化.結(jié)果表明:HEV感染A549細胞后細胞內(nèi)IFN-β的相對表達水平顯著下降,TLR3信號通路介導的pIRF3及IKKε蛋白在病毒感染后表達量顯著下降.基因Ⅳ型HEV能夠抑制TLR3信號通路介導的IRF3的磷酸化及IKKε蛋白的表達,從而抑制了IFN-β的表達,為進一步研究HEV復制機制和致病機理奠定基礎. 

【文章來源】：昆明理工大學學報(自然科學版). 2019,44(05)北大核心

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)．IFN－βmRNA在表明HEV抑制IFN－β的產(chǎn)生．素［11］．利中病毒拷染時間增長而增加(見

(I∶C)處理6h后轉(zhuǎn)染ORF3組，72h細胞活性無顯著下降(見圖1)．2.2HEV感染后抑制IFN－β的表達IFN－I的表達是宿主抗病毒感染的重要防御因素［11］．利用RT－qPCR檢測HEV感染不同時間點細胞上清中病毒拷貝數(shù)及IFN－β的表達．結(jié)果顯示，HEV拷貝數(shù)隨感染時間增長而增加(見圖2(a))．IFN－βmRNA在HEV感染后被顯著抑制(P＜0.001)(見圖2(b))．表明HEV抑制IFN－β的產(chǎn)生．(a)HEV拷貝數(shù)(b)IFN－βmRNA表達水平圖2RT－qPCR檢測HEV拷貝數(shù)和IFN－βmRNA表達水平的變化Fig.2HEVRNAcopynumber(a)andIFN－βmRNAexpression(b)detectedbyRT－qPCR2.3HEV感染抑制IRF3磷酸化轉(zhuǎn)錄因子IRF3激活后會誘導IFN－I表達，對抗病毒感染具有重要作用［12］．為了進一步探究IFN－β在HEV感染后期表達顯著降低的原因，我們通過Westernblot法檢測pIRF3蛋白在48h和72h的表達水27昆明理工大學學報(自然科學版)第44卷??????????????????????????????????????????????

平．用Poly(I∶C)刺激A549細胞6h后，接種HEV或過表達HEVORF3，同時設置空白對照組(MOCK)和單純Poly(I∶C)處理組．實驗結(jié)果顯示，Poly(I∶C)能夠顯著刺激pIRF3的表達;HEV感染組在48h和72h均顯著抑制pIRF3的表達;進一步證明過表達HEVORF3后，也能達到顯著抑制pIRF3蛋白表達的效果，說明HEV抑制pIRF3是通過ORF3發(fā)揮作用(見圖3)．圖3Westernblot檢測HEV感染后pIRF3蛋白水平的變化Fig.3TheexpressionofpIRF3inHEV－infectedA549cells48hand72hpost－infectionanalyzedbyWesternblot2.4HEV感染抑制IKKε的表達TLR3通路中IKKε和TBK1結(jié)合能夠使IRF3磷酸化，從而誘導IFN－I的生成．為了探究HEV感染后期pIRF3蛋白表達降低的原因，我們驗證了IKKε蛋白表達的變化．通過Westernblot檢測IKKε蛋白在48h和72h的表達水平．用Poly(I∶C)刺激A549細胞6h后，接種HEV或過表達HEVORF3，同時設置空白對照組(Mock)和單純Poly(I∶C)處理組．實驗結(jié)果顯示，與單純Poly(I∶C)處理組相比HEV感染組在48h和72h均能顯著抑制IKKε蛋白的表達;HEVORF3蛋白在72h也能顯著抑制IKKε蛋白的表達(見圖4)．說明在HEV感染后通過抑制IKKε的表達，進而抑制IRF3的磷酸化．2.5HEV感染后A549細胞內(nèi)炎癥因子的表達病毒感染機體后，宿主免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生大量具有抗病毒作用的炎癥因子，如IL6和IL8．為了進一步驗證HEV感染后細胞內(nèi)炎癥因子表達水平的變化，我們用RT－qPCR檢測HEV感染A549


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