隨著DNA重組技術(shù)應(yīng)用于抗體的改造，出現(xiàn)了人源化鼠單抗、小分子抗體、抗體融合蛋白等各種各樣的基因工程抗體，極大推進(jìn)了抗體在臨床上的應(yīng)用。但與天然的人抗體分子相比，小分子抗體結(jié)構(gòu)不完整，無法發(fā)揮Fc段介導(dǎo)的各種生物學(xué)效應(yīng)；人源化鼠單抗則不能完全消除抗體的異源性，仍會產(chǎn)生不同程度的HAMA，且親和力較低，而目前尚無一套成熟的可表達(dá)人完整抗體的表達(dá)體系。因此本研究針對以上問題，選擇了兼具原核系統(tǒng)良好操作性和真核系統(tǒng)后加工性的畢赤酵母表達(dá)體系進(jìn)行構(gòu)建和改良，以期建立一套可克隆、表達(dá)天然人完整抗體的真核表達(dá)體系。我們應(yīng)用基因重組技術(shù)，在畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα基礎(chǔ)上構(gòu)建完成了完整人抗體表達(dá)載體pPICZαIgG，并利用PCR介導(dǎo)的定位突變技術(shù)對其進(jìn)行改良，成功建立了完整人抗體表達(dá)體系。應(yīng)用該表達(dá)體系構(gòu)建重鏈（輕鏈）抗體表達(dá)文庫，利用抗體的抗原特異結(jié)合活性從中篩選出具有良好臨床應(yīng)用前景的抗-HBs抗體，進(jìn)一步在該體系中進(jìn)行重組表達(dá)及發(fā)酵純化，通過對重組蛋白的分析鑒定，評價畢赤酵母表達(dá)體系在全分子抗體克隆、篩選、表達(dá)及發(fā)酵等方面的作用，為治療性單抗的開發(fā)研制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一、完整人抗體表達(dá)... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

CH和CκPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜：

完 整 人 抗 乙 肝 表 面 抗 體 的 克 隆 及 重 組 表 達(dá) 輕鏈表達(dá)載體的構(gòu)建定區(qū) cDNA 的插入的 CH和 CκcDNA 分別經(jīng) EcoRⅠ+XbaⅠ消化酶部位,常規(guī)轉(zhuǎn)化、篩選。XhoI+XbaI 內(nèi)切酶p（CH）左右片段。（圖 2）與預(yù)測片段長度相隆到表達(dá)載體。結(jié)果與已發(fā)表的恒定區(qū)序列 99%同源。

改造輕鏈和重鏈重組于同一載體，得到完整人抗達(dá)載體作如下改造：鏈表達(dá)載體中引入 ClaI 位點(diǎn)體多拷貝串聯(lián)時連接方向性問題，應(yīng)用 PCR達(dá)盒末端引入新的酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)合成含有的 DNA 片段，分別與酶切后的重鏈和輕鏈表的表達(dá)載體。ClaI 酶切鑒定，不具有 ClaI 位重鏈、輕鏈表達(dá)載體 pPICZαIgH 和 pPICZα經(jīng) SalI 和 SpeI 酶切后電泳圖譜： 單酶切 pPICZαIgH；2. 重鏈表達(dá)載體 pPICZα 單酶切 pPICZαIgκ；4. 輕鏈表達(dá)載體 pPICZ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：2983793