本文關(guān)鍵詞：核仁素介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)在血管新生中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：前言：核仁素是一種重要的RNA結(jié)合蛋白,參與核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)和核糖體亞基組裝的調(diào)節(jié)。近期大量研究表明核仁素通過蛋白質(zhì)-RNA結(jié)合方式參與多個(gè)基因mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié),這些靶mRNA分子包括：Bcl-2、P53、GADD45. IL-2等。 我室以往的實(shí)驗(yàn)表明核仁素參與VEGF介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管型形成；而且核仁素心肌特異性表達(dá)可促進(jìn)小鼠缺血區(qū)心肌血管新生。上述結(jié)果提示,核仁素在血管新生調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,而且核仁素亦可能在心肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)血管新生相關(guān)因子的表達(dá),促進(jìn)其分泌,進(jìn)而調(diào)節(jié)血管新生過程。然而其具體機(jī)制是否與核仁素介導(dǎo)某些血管新生相關(guān)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有關(guān),目前尚不清楚。 方法：本研究首先采用生物信息學(xué)分析了多個(gè)人類血管新生相關(guān)基因的mRNA序列以篩選核仁素可能結(jié)合的mRNA靶分子。隨后以培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞H9C2和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為模型,采用蛋白質(zhì)-RNA免疫共沉淀結(jié)合定量PCR技術(shù)分別證實(shí)上述潛在靶分子與核仁素的相互作用,并進(jìn)一步通過基因轉(zhuǎn)染方式上調(diào)或下調(diào)核仁素蛋白表達(dá)策略,采用定量PCR技術(shù)分析核仁素對(duì)上述靶基因mRNA表達(dá)以及mRNA穩(wěn)定性的影響。最后建立以核仁素心肌特異性表達(dá)的小鼠心肌缺血模型,采用RNA-IP-PCR組合技術(shù)驗(yàn)證上述靶mRNA分子與核仁素的相互作用。通過本研究以期在轉(zhuǎn)錄后水平闡明核仁素對(duì)血管新生過程中的可能調(diào)控機(jī)制,為血管新生調(diào)控研究提供新的思路和視野。 結(jié)果： 1.通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)MMP9、VEGF、hETS1、VE-Cadherin、KDR、Tie-2、MMP2等多個(gè)血管新生相關(guān)基因mRNA的3'-UTR或5'-UTR或編碼區(qū)含有數(shù)量不等的核仁素結(jié)合元件"(T/G)CCCG(A/G)"序列。 2.采用蛋白質(zhì)-RNA免疫共沉淀技術(shù)結(jié)和Real-time PCR分析核仁素過表達(dá)的H9C2細(xì)胞發(fā)現(xiàn),上述潛在的核仁素結(jié)合靶分子中僅有MMP9和VEGF與核仁素蛋白具有相互作用。然而,在HUVEC細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),VE-cadherin、Endoglin、hETS1、Angiopoietin與核仁素蛋白具有相互作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)核仁素過表達(dá)時(shí),兩種細(xì)胞中具有相互作用的靶基因mRNA表達(dá)升高,相反,核仁素低表達(dá)時(shí),其表達(dá)則降低。 3.進(jìn)一步采用放線菌素D阻斷心肌細(xì)胞H9C2基因轉(zhuǎn)錄后,觀察已合成mRNA的降解速率發(fā)現(xiàn),核仁素過表達(dá)可以提高M(jìn)MP9基因mRNA的穩(wěn)定性,抑制其降解,而核仁素低表達(dá)則抑制MMP9基因mRNA的穩(wěn)定性,加速其降解。 4.為進(jìn)一步證明上述相互作用,本研究采用蛋白質(zhì)-RNA免疫沉淀分析核仁素特異性轉(zhuǎn)基因小鼠缺血心肌組織發(fā)現(xiàn)核仁素與MMP9的mRNA存在相互結(jié)合。 結(jié)論： 1.核仁素的促血管新生作用機(jī)制可能與核仁素與相關(guān)基因VEGF、MMP9、VE-cadherin、Endoglin、ETS1、和Angiopoietin的mRNA結(jié)合,通過影響其mRNA的穩(wěn)定性,從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平有關(guān)。 2.核仁素通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞MMP9mRNA穩(wěn)定性,促進(jìn)心肌細(xì)胞分泌MMP9參與血管新生的調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：血管新生 核仁素 RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 內(nèi)皮細(xì)胞 心肌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 目錄10-12
• 英文縮寫12-13
• 1 前言13-17
• 2 材料與方法17-24
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 2.1.2 細(xì)胞17
• 2.1.3 主要試劑及材料17
• 2.1.4 主要儀器17-18
• 2.1.5 引物序列18-19
• 2.2 方法19-24
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)19
• 2.2.2 動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組19
• 2.2.3 小鼠心肌缺血模型制備19
• 2.2.4 H9C2、HUVECs和心肌組織總蛋白提取和蛋白表達(dá)的免疫印跡分析19-20
• 2.2.5 H9C2、HUVECs總RNA的提取,逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timefluorescence quantitative PCR)分析20-21
• 2.2.6 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增和抽提21-22
• 2.2.7 脂質(zhì)體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染22
• 2.2.8 蛋白質(zhì)-RNA免疫共沉淀22
• 2.2.9 mRNA穩(wěn)定性分析22-23
• 2.2.10 統(tǒng)計(jì)分析23-24
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-34
• 3.1 生物信息學(xué)分析24
• 3.2 核仁素蛋白與血管新生相關(guān)基因mRNA的相關(guān)性24-27
• 3.2.1 大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)中與核仁素有相互作用的血管新生相關(guān)基因25-26
• 3.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中與核仁素有相互作用的血管新生相關(guān)基因26-27
• 3.3 核仁素過表達(dá)或表達(dá)抑制對(duì)上述血管新生基因mRNA的影響27-31
• 3.3.1 H9C2細(xì)胞株中核仁素過表達(dá)對(duì)上述血管新生基因mRNA的影響27
• 3.3.2 H9C2細(xì)胞株中核仁素抑制表達(dá)對(duì)上述血管新生基因mRNA的影響27-29
• 3.3.3 核仁素過表達(dá)對(duì)HUVECs細(xì)胞株中血管新生基因mRNA表達(dá)的影響29
• 3.3.4 HUVECs細(xì)胞中核仁素抑制表達(dá)對(duì)上述血管新生基因mRNA的影響29-31
• 3.4 核仁素對(duì)MMP9 mRNA穩(wěn)定性的影響31-32
• 3.4.1 核仁素過表達(dá)對(duì)MMP9 mRNA穩(wěn)定性的影響31-32
• 3.4.2 核仁素低表達(dá)對(duì)MMP9 mRNA穩(wěn)定性的影響32
• 3.5 小鼠心肌缺血模型中與核仁素有相互作用的血管新生相關(guān)基因32-34
• 4 討論34-36
• 5 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-42
• 綜述42-55
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 致謝55

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