發(fā)布時間：2017-04-10 23:14

  本文關(guān)鍵詞：mTOR和AMPK信號通路在谷氨酰胺調(diào)控豬腸上皮細(xì)胞生長中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究比較了不同水平的谷氨酰胺（L-glutamine，Gln）對腸上皮細(xì)胞生長和活力的影響，并探討mTOR與AMPK信號通路在Gln調(diào)控腸上皮細(xì)胞生長中的作用。 1．幾種氨基酸及其衍生物對腸上皮細(xì)胞生長的作用 研究L-谷氨酰胺(L-glutamine， Gln)， Nα-乙酰-L-谷氨酰胺（Nα-acetyl-L-glutamine，NAG），L-精氨酸（L-arginine，，ARG），N-α-乙酰-L-精氨酸（N-alpha-acetyl-L-arginine，NAA）、瓜氨酸（L-citrulline，CIT），α-酮戊二酸（Alpha-ketoglutaric acid，AKG）和L-脯氨酸（L-Proline，PRO）對豬小腸上皮細(xì)胞（Intestinal porcine epithelial cells，IPEC-1）細(xì)胞活力與生長的影響。在IPEC-1定制培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的氨基酸或其衍生物培養(yǎng)4天，用CCK8（cell counting kit8）法檢測細(xì)胞的活力，并用細(xì)胞計數(shù)法檢測這些氨基酸或其衍生物對細(xì)胞生長的影響。結(jié)果顯示：試驗(yàn)的整個四天，Gln組IPEC-1細(xì)胞的數(shù)量（P0.05）和OD值（P0.05）均顯著高于其他組。在試驗(yàn)的第4天，NAG、AKG、CIT、NAA和ARG組細(xì)胞數(shù)量均高于對照組（P0.05）。培養(yǎng)液中添加PRO對IPEC-1細(xì)胞的生長無明顯影響。 2．不同水平Gln對IPEC細(xì)胞生長的影響 為比較不同濃度Gln對細(xì)胞生長的影響，選出最適IPEC-1細(xì)胞生長的Gln水平，在IPEC-1定制培養(yǎng)液中分別添加不同水平的Gln（0，0.2，0.5，1，2，5mM）培養(yǎng)4天，用CCK8法檢測細(xì)胞的活力，并用細(xì)胞計數(shù)法檢測不同水平Gln對細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果表明：與其它Gln水平相比，2mM Gln組IPEC-1細(xì)胞數(shù)量最多且細(xì)胞的OD值最大。后三天，細(xì)胞生長數(shù)量與Gln（0-2mM）呈劑量-效應(yīng)依賴性。 3．Gln對IPEC-1細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)量的影響 為闡明Gln促進(jìn)腸上皮細(xì)胞生長的分子機(jī)理，在IPEC-1定制培養(yǎng)液中添加不同水平Gln（0，0.5，1，2，5mM）培養(yǎng)3天，實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測細(xì)胞mTOR和AMPK信號通路關(guān)鍵分子生長與生理、線粒體功能等相關(guān)分子mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示：2mM Gln上調(diào)了4EBP1、CFTR、SGLT-1、Na+/K+-ATPase、ZO-1、HSP70、COX7C和Bax mRNA的相對表達(dá)量（P0.05），但是下調(diào)了Akt、Bcl-2、IGFBP3和Sirt1mRNA相對表達(dá)量（P0.05）。 4．mTOR信號通路在Gln調(diào)控IPEC-1細(xì)胞生長中的作用 首先選用mTOR的抑制劑雷帕霉素（rapamycin，RAP）進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAP對IPEC-1細(xì)胞生長有抑制作用，且其對IPEC-1細(xì)胞的最適抑制濃度和處理時間分別為10nM和3d。然后采用2×2因子設(shè)計試驗(yàn)研究mTOR信號通路在Gln調(diào)控IPEC-1細(xì)胞生長中的作用。試驗(yàn)分為4個組：（1）0mM Gln，無RAP處理；（2）2mM Gln，無RAP處理；（3）0mM Gln，RAP處理；（4）2mM Gln，RAP處理。在IPEC-1定制培養(yǎng)液中分別添加相應(yīng)濃度的Gln和RAP培養(yǎng)3天，RT-PCR檢測Gln對RAP處理IPEC-1細(xì)胞mTOR和AMPK信號通路生長與生理、線粒體功能等相關(guān)分子mRNA的影響，Western Blot檢測Gln對RAP處理IPEC-1細(xì)胞mTOR和AMPK信號通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：（1）試驗(yàn)第3和4天，Gln可緩解RAP對細(xì)胞增殖的抑制作用；（2）添加Gln上調(diào)了IPEC-1細(xì)胞AMPKS6K14EBP1ASCT2BaxCFTRSGLT-1ZO-1ODCeIF2B和COX7C mRNA的相對表達(dá)量（P0.05），降低了AkteIF2α和MAPK6mRNA的相對表達(dá)量（P0.05）；（3）RAP處理使AMPKmTORS6K14EBP1ASCT2SGLT-1HSP70ZO-1ODCeIF2BBcl-xlBcl-2COX7C和Sirt1mRNA表達(dá)量增加（P0.05），但下調(diào)了eIF2αMAPK6和CFTR mRNA相對表達(dá)量（P0.05）；（4）與GAP組相比，Gln+RAP組細(xì)胞4EBP1、HSP70、ZO-1、Bcl-xl、eIF2B和Sirt1mRNA的相對表達(dá)量降低（P0.05）；（5）RAP處理抑制了細(xì)胞mTOR和S6K1的磷酸化，并降低p-S6K1/S6K1比值（P0.05）。 5．AMPK信號通路在Gln調(diào)控IPEC-1細(xì)胞生長中的作用 首先選用AMPK的抑制劑P5499對細(xì)胞進(jìn)行處理，研究發(fā)現(xiàn)P5499對IPEC-1細(xì)胞生長有抑制作用，且其對IPEC-1細(xì)胞的最適抑制濃度和處理時間分別為1μM和3d。然后設(shè)計2×2因子試驗(yàn)探究AMPK信號通路在Gln調(diào)控IPEC-1細(xì)胞生長中的作用。試驗(yàn)分為4個組：（1）0nM Gln，無P5499處理；（2）2mMGln，無P5499處理；（3）0nM Gln，P5499處理；（4）2mM Gln，P5499處理。在IPEC-1定制培養(yǎng)液中添加相應(yīng)的Gln和P5499培養(yǎng)3天，RT-PCR檢測培養(yǎng)基中添加Gln對P5499處理IPEC-1細(xì)胞mTOR和AMPK信號通路生長與生理及線粒體功能相關(guān)分子mRNA的影響，Western Blot檢測添加Gln對P5499處理IPEC-1細(xì)胞mTOR和AMPK信號通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：（1）Gln緩解了P5499對細(xì)胞活力的抑制作用和第三天對細(xì)胞增殖的抑制作用；（2）Gln降低了Akt和Sirt1mRNA的相對表達(dá)量，但是提高了mTORS6K14EBP1CFTRSGLT-1HSP70ZO-1ASCT2ODCBaxBcl-2eIF2B和COX7C mRNA的表達(dá)量（P0.05）；（3）P5499處理上調(diào)了AktAMPKASCT2和eIF2B mRNA表達(dá)（P0.05），但是降低了Bcl-2SGLT-1HSP70和Bcl-xl mRNA表達(dá)量（P0.05）；（4）與P5499組相比，Gln+P5499組細(xì)胞的AMPKCFTRSGLT-1和ZO-1mRNA的相對表達(dá)量降低；（5）2mMGln提高了AMPK蛋白的相對表達(dá)量（P0.05）；（6）P5499處理提高了AMPK蛋白的相對表達(dá)量，但是下調(diào)了p-mTOR蛋白表達(dá)（P0.05）。 總之，本試驗(yàn)研究表明，IPEC-1細(xì)胞培養(yǎng)液中Gln的最適添加水平為2mM。2mM Gln提高了IPEC-1細(xì)胞的4EBP1、CFTR、SGLT-1、Na+K+-ATPase、ZO-1、HSP70、COX7C等基因的相對表達(dá)量，下調(diào)了Akt、Bcl-2、IGFBP3、Sirt1等基因的表達(dá)量。Gln調(diào)控IPEC-1的細(xì)胞生長可能與mTOR信號通路分子4EBP1基因表達(dá)、S6K1蛋白表達(dá)和AMPK信號通路分子AMPK蛋白表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：谷氨酰胺 腸上皮細(xì)胞 mTOR信號通路 AMPK信號通路
【學(xué)位授予單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 縮寫詞16-18
• 第一章 緒論18-32
• 1.1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀18-30
• 1.1.1 谷氨酰胺的理化性質(zhì)18
• 1.1.2 谷氨酰胺對腸道組織和腸上皮細(xì)胞的作用18-19
• 1.1.3 mTOR 信號通路研究進(jìn)展19-24
• 1.1.4 AMPK 信號通路研究進(jìn)展24-30
• 1.2 研究的目的與意義30-31
• 1.3 研究內(nèi)容31-32
• 第二章 試驗(yàn)研究32-98
• 試驗(yàn)一 幾種氨基酸及其衍生物對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響32-42
• 1.1 材料與方法33-37
• 1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑33
• 1.1.2 培養(yǎng)基配方33-35
• 1.1.3 試驗(yàn)分組35-36
• 1.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)36
• 1.1.5 測定指標(biāo)與方法36
• 1.1.6 數(shù)據(jù)處理36-37
• 1.2 結(jié)果37-39
• 1.2.1 NAG 和 Gln 對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響37
• 1.2.2 ARG、NAA、CIT 和 AKG 對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響37-38
• 1.2.3 PRO 對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響38-39
• 1.3 討論39-41
• 1.3.1 Gln 和 NAG 對 IPEC-1 細(xì)胞活力與生長的影響39
• 1.3.2 AKG 對 IPEC-1 細(xì)胞活力與生長的影響39-40
• 1.3.3 ARG 和 NAA 對 IPEC-1 細(xì)胞活力與生長的影響40
• 1.3.4 CIT 對 IPEC-1 細(xì)胞活力與生長的影響40-41
• 1.3.5 PRO 對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響41
• 1.4 小結(jié)41-42
• 試驗(yàn)二 不同水平 Gln 對 IPEC 細(xì)胞生長的影響42-46
• 2.1 材料和方法42-43
• 2.1.1 試驗(yàn)材料與試劑42
• 2.1.2 培養(yǎng)基配方42
• 2.1.3 試驗(yàn)分組42-43
• 2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)43
• 2.1.5 測定指標(biāo)與方法43
• 2.1.6 數(shù)據(jù)處理43
• 2.2 試驗(yàn)結(jié)果43-44
• 2.2.1 不同水平 Gln 對細(xì)胞活力的影響43-44
• 2.2.2 不同水平 Gln 對細(xì)胞數(shù)量的影響44
• 2.3 討論44-45
• 2.4 小結(jié)45-46
• 試驗(yàn)三 Gln 對 IPEC-1 細(xì)胞相關(guān)基因 mRNA 表達(dá)的影響46-61
• 3.1 材料與方法46-50
• 3.1.1 試驗(yàn)材料與方法46
• 3.1.2 培養(yǎng)基配方46
• 3.1.3 試驗(yàn)分組46-47
• 3.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)47
• 3.1.5 測定指標(biāo)與方法47-50
• 3.1.6 數(shù)據(jù)分析50
• 3.2 試驗(yàn)結(jié)果50-53
• 3.2.1 Gln 對 EGFR、mTOR 和 AMPK 信號通路關(guān)鍵分子的基因表達(dá)量的影響50-51
• 3.2.2 Gln 對生長與生理功能相關(guān)分子 mRNA 相對表達(dá)量的影響51-52
• 3.2.3 Gln 對線粒體功能方面蛋白 mRNA 相對表達(dá)量的影響52-53
• 3.3 討論53-60
• 3.3.1 Gln 對 EGFR、mTOR 和 AMPK 信號通路關(guān)鍵分子 mRNA 的相對表達(dá)量的影響53-55
• 3.3.2 Gln 對生長與生理功能相關(guān)分子 mRNA 相對表達(dá)量的影響55-59
• 3.3.3 Gln 對線粒體功能方面基因 mRNA 相對表達(dá)量的影響59-60
• 3.4 小結(jié)60-61
• 試驗(yàn)四 mTOR 信號通路在 Gln 調(diào)控腸上皮細(xì)胞生長中的作用61-80
• 4.1 材料與方法61-64
• 4.1.1 試驗(yàn)材料與方法61
• 4.1.2 培養(yǎng)基配方61-62
• 4.1.3 試驗(yàn)分組62
• 4.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)62
• 4.1.5 測定指標(biāo)與方法62-64
• 4.1.6 數(shù)據(jù)分析64
• 4.2 試驗(yàn)結(jié)果64-75
• 4.2.1 不同水平 RAP 對 IPEC 細(xì)胞生長的影響64-65
• 4.2.2 添加 Gln 與 RAP 處理對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響65-67
• 4.2.3 Gln 對 RAP 處理 IPEC-1 細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)量的影響67-69
• 4.2.4 添加 Gln 與 RAP 處理對細(xì)胞 mTOR 和 AMPK 信號通路蛋白表達(dá)的影響69-75
• 4.3 討論75-78
• 4.3.1 RAP 對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響75-76
• 4.3.2 Gln 對 RAP 處理 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響76
• 4.3.3 Gln 對 RAP 處理 IPEC-1 細(xì)胞相關(guān) mRNA 相對表達(dá)量的影響76-78
• 4.3.4 添加 Gln 與 RAP 處理對 IPEC-1 細(xì)胞 mTOR 和 AMPK 信號通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的影響78
• 4.4 小結(jié)78-80
• 試驗(yàn)五 AMPK 信號通路在 Gln 調(diào)控腸上皮細(xì)胞生長中的作用80-98
• 5.1 材料與方法80-82
• 5.1.1 試驗(yàn)材料與方法80
• 5.1.2 培養(yǎng)基配方80
• 5.1.3 試驗(yàn)分組80-81
• 5.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)81
• 5.1.5 測定指標(biāo)與方法81
• 5.1.6 數(shù)據(jù)分析81-82
• 5.2 試驗(yàn)結(jié)果82-94
• 5.2.1 P5499 對 IPEC 細(xì)胞生長的影響82-83
• 5.2.2 添加 Gln 與 P5499 處理對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響83-85
• 5.2.3 Gln 對 P5499 處理的 IPEC 細(xì)胞相關(guān)基因 mRNA 相對表達(dá)量的影響85-87
• 5.2.4 添加 Gln 與 P5499 處理對細(xì)胞 mTOR 和 AMPK 信號通路蛋白表達(dá)的影響87-94
• 5.3 討論94-97
• 5.3.1 P5499 對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響94-95
• 5.3.2 Gln 與 P5499 處理對 IPEC-1 細(xì)胞生長的影響95
• 5.3.3 Gln 與 P5499 處理對 IPEC-1 細(xì)胞相關(guān)基因 mRNA 相對表達(dá)量的影響95-96
• 5.3.4 Gln 與 P5499 處理對細(xì)胞 mTOR 和 AMPK 信號通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的影響96-97
• 5.4 小結(jié)97-98
• 第三章 結(jié)論和建議98-99
• 3.1 主要結(jié)論98
• 3.2 創(chuàng)新點(diǎn)98
• 3.3 有待進(jìn)一步研究的問題98-99
• 參考文獻(xiàn)99-121
• 致謝121-122
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果122

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：297760