1993年,Serrano等利用酵母雙雜交技術(shù)在篩選與人CDK4相關(guān)的蛋白時(shí)找到一個(gè)能有效地抑制CDK4活性、相對(duì)分子質(zhì)量為16 ku的蛋白質(zhì),將其命名為p16蛋白。p16基因（p16,MTS1,CDKN2）位于人類第9號(hào)染色體短臂2區(qū)1帶區(qū)域(9P²¹)。PCR和Southern雜交證實(shí)在黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、白血病中p16基因經(jīng)常發(fā)生缺失、重排及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的喪失。目前p16研究主要集中在腫瘤發(fā)生中p16失活方式及作為抗腫瘤藥物研究等方面,在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物水平的研究很少。我們構(gòu)建p16真核表達(dá)載體pCR^?3.1/p16,建立其穩(wěn)定表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞株,應(yīng)用顯微注射法制備攜帶人p16基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,可為將來(lái)在個(gè)體水平研究p16基因的功能奠定基礎(chǔ)。 本研究共分兩部分,第一部分是p16真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞株的建立;第二部分是用顯微注射法制備攜帶人p16基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。 第一部分 p16真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞株的建立 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?構(gòu)建pCR^R

【文章來(lái)源】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

重組表達(dá)質(zhì)粒的初步酶切鑒定(EcoRI)

受態(tài)大腸桿菌DH5a，從含氨節(jié)青霉素的LB平板中隨機(jī)挑出8個(gè)抗性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，常規(guī)堿裂解法提取質(zhì)粒，并經(jīng)EcoRI和Xh0I酶解后，0.9%瓊脂糖電泳測(cè)定(圖1.2，圖1.3)。12345678910................~~..............圖1.2重組表達(dá)質(zhì)粒的初步酶切鑒定(EcoRI)1一攤一、9一10:8個(gè)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒;3、8:pcRO3.1載體1234M................1:pCR.3.1(EeoRI);蘭衛(wèi)魚(yú)留，艾口2，刃pCR’3.l/pl6(EeoRI):4:pCR’3.1/p16(EeoRI+xhol);一!口扣一二匆M:Marker圖1.3重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定2.2表達(dá)質(zhì)粒pcR⑧3.1/p6l的測(cè)序重組娜妙3.1/p6l序列測(cè)定結(jié)果(圖1.4)顯示p16cDNA堿基序列按照預(yù)期方式定向插人表達(dá)載體，且接口處序列正確，但是比正常讀碼框架啟始密碼子前多了編碼8個(gè)氨基酸的密碼子序列a華名gaccggcggc引交絕gacgac，

圖2.5仔鼠基因組DNA討轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指以實(shí)驗(yàn)的方法導(dǎo)人整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。轉(zhuǎn)基密結(jié)合而產(chǎn)生的基因工程動(dòng)物，轉(zhuǎn)基因動(dòng)一起來(lái)，使人們能夠從時(shí)間與空間四維律，除用于建立醫(yī)學(xué)研究的各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)展生物反應(yīng)器研究，獲得人類所需要的的生物制品。自從1980年Go而n等[‘〕報(bào)道用原，


本文編號(hào)：2957298