高等真核生物細(xì)胞信使RNA （mRNA）及一些病毒RNA的5’-端均具有N7或者2’-O甲基化修飾的帽子結(jié)構(gòu)。同時(shí),5’端的帽子修飾具有很多重要的生物學(xué)功能：保護(hù)信使RNA避免被5’外切酶降解；指導(dǎo)前體信使RNA的剪切及核輸出；保證信使RNA的穩(wěn)定性及有效的翻譯。除此以外,2’-O帽子修飾已被證明可以幫助冠狀病毒逃避胞內(nèi)識(shí)別病毒雙鏈RNA的受體MDA5（melanoma differentiation-associated gene5）的識(shí)別及干擾素誘導(dǎo)蛋白IFIT （IFN-induced proteins with tetratricopeptide repeats）介導(dǎo)的免疫抑制。由于病毒本身的加帽過(guò)程、機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)信使RNA的加帽存在很大差別,使病毒加帽酶作為抗病毒藥物靶標(biāo)成為可能。目前冠狀病毒加帽酶抑制劑篩選平臺(tái)的建立及冠狀病毒甲基化修飾與免疫逃逸之間的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)。本研究中,我們?cè)诮湍妇δ芑パa(bǔ)遺傳系統(tǒng)之上構(gòu)建了抑制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的冠狀病毒加帽抑制劑篩選平臺(tái)。該平臺(tái)以96、384微孔板作為篩選工具,通過(guò)吸光值法直接測(cè)定表達(dá)冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白14（Coronavirus ... 

【文章來(lái)源】：武漢大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
本論文的創(chuàng)新點(diǎn)
摘要
Abstract
引言
第一部分 概述冠狀病毒及其反向遺傳學(xué)系統(tǒng)和加帽修飾
    1 冠狀病毒
        1.1 冠狀病毒造成的疾病
            1.1.1 人冠狀病毒
            1.1.2 鼠冠狀病毒
        1.2 冠狀病毒
            1.2.1 冠狀病毒的分類(lèi)
            1.2.2 冠狀病毒基因組及病毒粒子
            1.2.3 冠狀病毒的生活周期
            1.2.4 冠狀病毒的復(fù)制
            1.2.5 病毒蛋白
        1.3 冠狀病毒的反向遺傳學(xué)
            1.3.1 定向重組
            1.3.2 從cDNA中重新形成病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)
        1.4 冠狀病毒與先天免疫逃逸
            1.4.1 宿主抗病毒先天免疫及對(duì)SARS-CoV感染的反應(yīng)
            1.4.2 SARS-CoV通過(guò)DMVs保護(hù)及加帽修飾逃逸宿主先天免疫的識(shí)別
        1.5 抗冠狀病毒藥物研究進(jìn)展
            1.5.1 抗冠狀病毒藥物
            1.5.2 冠狀病毒疫苗
    2 mRNA加帽機(jī)制及其功能酶研究概要
        2.1 5’末端帽子的結(jié)構(gòu)、功能及加帽過(guò)程
        2.2 加帽修飾相關(guān)功能酶簡(jiǎn)介
            2.2.1 RNA三磷酸酶的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制
            2.2.2 鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制
            2.2.3 甲基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制
        2.3 生物體內(nèi)參與加帽過(guò)程的酶組成
        2.4 病毒的加帽機(jī)制
            2.4.1 病毒傳統(tǒng)的加帽修飾方式
            2.4.2 病毒非傳統(tǒng)的加帽方式
        2.5 病毒加帽修飾與先天免疫
        2.6 針對(duì)加帽酶的抑制劑
            2.6.1 三磷酸酶抑制劑
            2.6.2 鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑
            2.6.3 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑
        2.7 甲基供體SAM的基本特性
第二部分 冠狀病毒甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的篩選
篩選冠狀病毒甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑">    3 酵母菌功能性互補(bǔ)及酵母生長(zhǎng)抑制系統(tǒng)的構(gòu)建_篩選冠狀病毒甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑
        3.1 研究背景概述
        3.2 實(shí)驗(yàn)材料
            3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
            3.2.2 菌種及質(zhì)粒
            3.2.3 工具酶、試劑盒及試劑
            3.2.4 相關(guān)溶液
        3.3 實(shí)驗(yàn)方法、原理
            3.3.1 引物設(shè)計(jì)
            3.3.2 酵母菌表達(dá)質(zhì)粒及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.3.3 DNA目的片段擴(kuò)增及質(zhì)粒DNA的實(shí)驗(yàn)操作
            3.3.4 酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            3.3.5 轉(zhuǎn)化酵母菌在5-FOA上的篩選
            3.3.6 冠狀病毒nsp14的體外表達(dá)、純化、活性測(cè)試及藥物抑制
        3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論部分
            3.4.1 所有冠狀病毒nsp14都能互補(bǔ)酵母N7-MTase的功能
            3.4.2 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)吸光值法能準(zhǔn)確反映酵母細(xì)胞的數(shù)目
            3.4.3 體外生化檢測(cè)藥物對(duì)冠狀病毒N7-MTase活性的影響
            3.4.4 以酵母遺傳學(xué)為基礎(chǔ)冠狀病毒N7-MTase抑制劑篩選平臺(tái)的建立
            3.4.5 檢測(cè)酵母遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的篩選平臺(tái)的有效性
            3.4.6 蹄選抑制冠狀病毒N7-MTase的天然化合物藥庫(kù)
            3.4.7 優(yōu)化冠狀病毒N7-MTase抑制劑的篩選體系
第三部分 鼠肝炎冠狀病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立
    4 重組突變鼠肝炎冠狀病毒的構(gòu)建
        4.1 研究背景概述
        4.2 實(shí)驗(yàn)材料
            4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
            4.2.2 病毒、菌種及質(zhì)粒
            4.2.3 實(shí)驗(yàn)用耗材
        4.3 實(shí)驗(yàn)方法及原理
            4.3.1 引物設(shè)計(jì)
            4.3.2 以痘苗病毒為載體的全長(zhǎng)MHV重組病毒（V.V-inf-1）的擴(kuò)增及噬斑分析
            4.3.3 pGPT-out-nsp14同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.3.4 痘苗病毒介導(dǎo)的同源重組
            4.3.5 GPT雙向篩選
            4.3.6 重組痘苗病毒DNA的提取及PCR鑒定
            4.3.7 GPT-Out重組痘苗病毒DNA的提取、酶切與體外轉(zhuǎn)錄
            4.3.8 突變MHV基因組全長(zhǎng)RNA的轉(zhuǎn)染及拯救
            4.3.9 MHV突變體的純化與鑒定
            4.3.10 MHV突變體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
            4.4.1 重組痘苗病毒V.V-MHV-A59 nsp14-gpt in的增殖及滴度測(cè)定
            4.4.2 鼠肝炎冠狀病毒基因組DNA的定向突變
            4.4.3 MHV突變體的拯救
            4.4.4 MHV-nsp14-mutants的增殖、噬斑分析及溫度敏感性測(cè)試
            4.4.5 MHV-nsp14-mutants生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
    5 討論與展望
參考文獻(xiàn)
研究生期間發(fā)表論文
致謝



本文編號(hào)：2956459