對乙型肝炎病毒（HBV）野生株及核殼蛋白變異株L97和V60在HepG₂細胞HLA-I表面表達的特性及其調(diào)節(jié)機制進行初步探討，試圖認識病毒及其變異與宿主細胞相互作用和影響。 構(gòu)建HBV基因組野生株和核殼蛋白變異株穩(wěn)定表達載體，提供實驗研究的基礎(chǔ)材料。通過定點突變技術(shù)將1.2拷貝HBV（adr亞型）野生株質(zhì)粒p3.8Ⅱ構(gòu)建成核殼蛋白變異株L97和V60質(zhì)粒，經(jīng)序列測定證實nt2189A→C和nt2078C→G。3株質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG₂細胞DNA的Southern blot雜交均顯示明顯的3.8kb雜交帶，培養(yǎng)上清均測定出HBV抗原，表明具有生物活性，分別亞克隆入EB病毒表達載體EBO-plpp使能穩(wěn)定表達。重組載體EBO-WT、EBO-L97和EBO-V60作限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及再次測序確定點突變。 測定HBV野生株和變異株L97、V60誘導(dǎo)HepG₂細胞膜HLA-I／抗原肽復(fù)合物表達的強度，探討各株在宿主細胞HLA-I表面表達的特性及核殼蛋白熱點變異對HLA-I表達的影響。3株HBV重組載體及EBO空載體分別... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：39 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

HBv野生株及核殼蛋白變異株質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞HBVDNASouthern雜交結(jié)果

圖6HBv轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HLA一AmRNA表達M:PCR分子量標準(l543，94，697，515，377，237bP);Lanel:EBO一L97;LaneZ:EBO一WT;Lane3:EBO一V60;Lane4:EBO空載體圖7HBV轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HLA一A蛋白質(zhì)表達的WesternBlot分析Lanel:EBO一V60;LaneZ:EBO一L97;Lane3:EBO一WT;Lane4:EBO空載體:M:蛋白分子量標準表明HBV上調(diào)了轉(zhuǎn)染細胞的HLA一A基因轉(zhuǎn)錄水平，其上調(diào)水平的差異與轉(zhuǎn)染細胞表面HLA一I表達熒光強度的差別基本一致。W亡Stemblot檢測顯示3株重組載體轉(zhuǎn)染細胞均呈現(xiàn)明顯的45kDa左右的蛋白帶，符合HLA一1重鏈分子量大小，3株HBV呈現(xiàn)的區(qū)帶強度以L97最強，WT次之，V6O最弱，EBO空載體轉(zhuǎn)染細胞未出現(xiàn)可見的蛋白帶(圖7)，表明HBV轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HLA一1蛋白質(zhì)表達水平明顯上調(diào)，3株HBV表達水平的差別與其細胞表面HLA一1表達熒光強度的差別趨

轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HLA一I抗原提呈相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平:PZ、TAPI、幾pasin引物用RT一PCR半定量法檢測3株O空載體轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果均未TapasincDNA可見的擴增帶。3株HBV宿主細胞bp的擴增區(qū)帶，各株的區(qū)帶強度無明顯差別，EBO微弱的區(qū)帶(圖8，Lane4一7)。實驗表明HBV轉(zhuǎn)染H及Tapasin基因轉(zhuǎn)錄水平無變化，而TAPI基因轉(zhuǎn)錄株和變異株表達水平相似。


本文編號：2943993