目的:研究細(xì)胞外半胱氨酸/胱氨酸氧化還原電位（EhCys/Cy SS）對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）肝細(xì)胞線粒體功能的影響。方法:用EhCys/Cy SS分別為0 m V（氧化）、-80 m V（正常）和-150 m V（還原）的氧化還原培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞株LO2并采用油酸誘導(dǎo)細(xì)胞建立NAFLD模型。熒光探針DCFH-DA和Mito SOX分別檢測(cè)細(xì)胞整體水平和線粒體活性氧簇（ROS）生成,使用apocynin（NADPH氧化酶抑制劑）和Mito Q10（靶向線粒體抗氧化劑）、rotenone（線粒體呼吸鏈復(fù)合體I抑制劑）和antimycin A（線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ抑制劑）作用細(xì)胞檢測(cè)線粒體復(fù)合體活性從而探究ROS的來源,JC-1檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。結(jié)果:油酸誘導(dǎo)的NAFLD細(xì)胞模型使肝細(xì)胞內(nèi)ROS增多,線粒體膜電位下降;氧化的EhCys/Cy SS加劇了NAFLD肝細(xì)胞ROS的生成以及線粒體膜電位的下降,而還原的EhCys/Cy SS能清除ROS并逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位的下降。線粒體ROS清除劑Mito Q10能顯著地減少氧化的EhCys/Cy SS所增加的ROS,而apocynin效果... 

【文章來源】：中國(guó)病理生理雜志. 2015年07期 北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

EhCys/CySS對(duì)NAFLD肝細(xì)胞ＲOS生成的影響

Figure2．ThesourceofＲOSintheLO2cellstreatedwiththeoxidizedEhCys/CySS．Mean±SD．n=6．△P＜0.05，△△P＜0.01vsC(0mV);##P＜0.01vsC(－150mV);＊＊P＜0.01vsC(－80mV);++P＜0.01vsrotenone(－80mV)．圖2氧化的EhCys/CySS作用下LO2細(xì)胞ＲOS的來源3氧化的EhCys/CySS抑制線粒體復(fù)合體I活性由上面的實(shí)驗(yàn)可知，氧化的細(xì)胞外狀態(tài)下LO2細(xì)胞ＲOS主要來源于線粒體。為了進(jìn)一步探究線粒體內(nèi)ＲOS產(chǎn)生機(jī)制，實(shí)驗(yàn)針對(duì)線粒體呼吸鏈產(chǎn)生ＲOS的環(huán)節(jié)，選擇線粒體復(fù)合體I和III的抑制劑，rotenone(2μmol/L)和antimycinA(5μmol/L)［16］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2種抑制劑作用后都使細(xì)胞ＲOS生成增加;但是antimycinA孵育細(xì)胞后，各組細(xì)胞ＲOS的增加率與細(xì)胞外EhCys/CySS無關(guān)，而復(fù)合體I抑制劑rotenone作用后ＲOS的增加率與細(xì)胞外EhCys/CySS呈相關(guān)趨勢(shì)，即0mV時(shí)增加了23.5%，－150mV時(shí)增加了151.6%。實(shí)驗(yàn)說明氧化的EhCys/CySS可能通過抑制線粒體復(fù)合體I活性來增加ＲOS的生成。使用線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)假設(shè)。結(jié)果顯示0mV時(shí)線粒體復(fù)合體I的活性只有正常狀態(tài)下細(xì)胞的42%，而－150mV時(shí)細(xì)胞復(fù)合體I活性輕微增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了氧化的EhCys/CySS通過抑制線粒體復(fù)合體I活性來增加ＲOS的生成，見圖2。4細(xì)胞外EhCys/CySS對(duì)LO2細(xì)胞線粒體膜電位的影響如圖3所示，與C組相比，油酸使OA組細(xì)胞線粒體膜電位下降，JC-1染色由紅色向橙色轉(zhuǎn)變，綠色熒光與紅色熒光的比值由65%增長(zhǎng)到82%(P＜0.01);與正常生理狀態(tài)(－80mV)相比，氧化狀態(tài)(0mV)使NAFLD肝細(xì)胞線粒體膜電位進(jìn)一步下降，JC-1染色由橙色向綠色轉(zhuǎn)變，綠色/紅色熒光比值由82%增長(zhǎng)到110%(P＜0.01);還原狀態(tài)(－150

Figure3．TheeffectsofEhCys/CySSonthemitochondrialmembranepotentialofOAtreatedLO2cells．Mean±SD．n=6．*P＜0.05，＊＊P＜0.01vsOA(－80mV)．圖3EhCys/CySS對(duì)LO2細(xì)胞線粒體膜電位的影響分子量硫醇/二硫化物物質(zhì)對(duì)［1］，肥胖、糖尿并化療、酗酒、抽煙等往往伴隨著血漿中EhCys/CySS的氧化［2］，越來越多研究表明氧化的EhCys/CySS與脂質(zhì)代謝性疾病的危險(xiǎn)因素有關(guān)。Imhoff等［5］研究表明高脂飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠血漿EhCys/CySS氧化，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明細(xì)胞外液氧化的EhCys/CySS能加劇脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成，而還原的EhCys/CySS能改善脂質(zhì)沉積。Thong等［17］研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸能改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠氧化應(yīng)激和肝脂質(zhì)沉積及炎癥癥狀。而且，N-乙酰半胱氨酸作為L(zhǎng)-cys-teine的前體，能使血漿中EhCys/CySS還原［18］。因此，血漿中氧化的EhCys/CySS可能對(duì)NAFLD發(fā)生發(fā)展起重要作用。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以Cys、CySS和Cys-freeDMEM培養(yǎng)基模擬人體氧化、正常和還原的細(xì)胞外環(huán)境培育LO2細(xì)胞并以油酸建立NAFLD模型。研究中發(fā)現(xiàn)油酸NAFLD模型能使細(xì)胞ＲOS增加線粒體膜電位降低，而氧化的EhCys/CySS(0mV)加劇了ＲOS的生成并使線粒體膜電位進(jìn)一步下降，還原的EhCys/CySS(－150mV)能清除ＲOS并糾正降低的膜電位。線粒體ＲOS清除劑MitoQ10顯著減少了由氧化EhCys/CySS所增加的ＲOS。線粒體復(fù)合體I抑制劑rotenone作用于細(xì)胞后，ＲOS的增長(zhǎng)率與細(xì)胞外EhCys/CySS有關(guān)，0mV時(shí)ＲOS的增長(zhǎng)率很小并且線粒體復(fù)合體I活性減弱。實(shí)驗(yàn)說明，對(duì)于高脂培養(yǎng)的LO2肝細(xì)胞，細(xì)胞外液氧化的EhCys/CySS能通過抑制線粒體復(fù)合體I加劇肝細(xì)胞ＲOS的生成，并使線粒體

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]mfn2基因轉(zhuǎn)染對(duì)非酒精性脂肪肝細(xì)胞線粒體功能的影響[J]. 張勇,胡文君,王堯,夏耘,鄭啟昌.  中國(guó)病理生理雜志. 2010(03)
[2]N-acetylcysteine attenuates oxidative stress and liver pathology in rats with non-alcoholic steatohepatitis[J]. Duangporn Thong-Ngam,Suchittra Samuhasaneeto,Onanong Kulaputana,Naruemon Klaikeaw.  World Journal of Gastroenterology. 2007(38)



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