本文關(guān)鍵詞：MHC-I類似分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex, MHC)在免疫系統(tǒng)中的作用已經(jīng)得到了廣泛的研究。其中的MHC-I分子表達(dá)于全身所有有核細(xì)胞的表面，在免疫細(xì)胞的發(fā)育、抗原識(shí)別和T細(xì)胞免疫應(yīng)答等方面起著重要的作用。此外，MHC-I還與NK細(xì)胞（natrural killer cell）的抑制性受體結(jié)合，抑制NK細(xì)胞對(duì)表達(dá)自身MHC-I分子的細(xì)胞的殺傷作用。另一方面，對(duì)于NK細(xì)胞而言，除了抑制性受體外，它們還表達(dá)一些激活性受體，其中的NKG2D可以被一些MHC-I類似分子激活，從而拮抗MHC-I對(duì)NK細(xì)胞的抑制作用。 目前已發(fā)現(xiàn)的NKG2D的配體(NKG2D ligand, NKG2DL)都是MHC-I的類似分子，鼠類包括三個(gè)家族：Rae-1（α, β, γ, δ和ε），Mult1和H60(a, bc)；人類包括兩個(gè)家族：MIC (A、B)和ULBP (1-6)。借由NKG2D受體，這些MHC-I類似分子在NK細(xì)胞中起著與MHC-I相反的作用，即對(duì)NK細(xì)胞的激活作用。這些MHC-I類似分子通常只在有問(wèn)題的細(xì)胞，如轉(zhuǎn)化、病毒感染和有DNA損傷的細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)表達(dá)MHC-I類似分子(NKG2DL)，進(jìn)而NKG2D受體激活NK細(xì)胞，使這些有問(wèn)題的細(xì)胞得以清除。因此，MHC-I類似分子和NK細(xì)胞的NKG2D一起，形成一道防止有問(wèn)題細(xì)胞在體內(nèi)存活的天然屏障。 MHC-I及其類似分子是否只在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用呢？對(duì)MHC-I的研究表明，它在神經(jīng)系統(tǒng)中同樣起著關(guān)鍵作用。MHC-I廣泛表達(dá)在胚胎、新生及成年小鼠及人腦中，其在神經(jīng)元中的表達(dá)具有時(shí)空特異性和可調(diào)節(jié)性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MHC-I對(duì)神經(jīng)功能的可塑性也起著重要作用。多種MHC-I的受體如Ly49等也在神經(jīng)元中表達(dá)。 那是否MHC-I類似分子的作用就只局限于免疫系統(tǒng)呢？實(shí)際上Rae-1在體內(nèi)的表達(dá)最初是在胚胎鼠的前腦中發(fā)現(xiàn)的，它的表達(dá)伴隨著胚胎神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期（E13-E18），且Rae-1家族成員的表達(dá)有時(shí)空和量的差別。這之后意外發(fā)現(xiàn)其作為NKG2D的配體在免疫系統(tǒng)中的作用，而使Rae-1在神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中可能作用的研究被忽略了，只有極少對(duì)于Rae-1的研究涉及神經(jīng)領(lǐng)域。鑒于已發(fā)現(xiàn)MHC-I分子在神經(jīng)中的表達(dá)及重要作用，以及多種神經(jīng)與免疫系統(tǒng)間的相似性，我們有理由相信MHC-I類似分子同樣在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。 為了研究Rae-1等MHC-I類似分子在小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的可能作用，本課題的主要目標(biāo)是系統(tǒng)研究這些分子及其受體在胚胎發(fā)育及成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)及其蛋白的定位，包括利用RT-PCR和原位分子雜交分析這些基因的表達(dá)，免疫組織化學(xué)分析這些蛋白在中樞神經(jīng)的分布，以及免疫熒光標(biāo)記確定Rae-1蛋白在神經(jīng)細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的定位。首先通過(guò)對(duì)Rae-1五種亞型的比對(duì)和引物設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)出能擴(kuò)增全部Rae-1成員和Mult1、H60的三個(gè)成員、以及NKG2D的引物，利用RT-PCR分析這些基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除H60外，這些基因全部在胚胎及成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較高表達(dá)；此外，定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，胚胎10-18天小鼠的胚胎腦中這些基因的表達(dá)最高，出生前表達(dá)顯著降低，，但在成年腦中仍維持低水平表達(dá)。以上結(jié)果表明，與MHC-I分子一樣，MHC-I類似分子也都在發(fā)育中及成年后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)；此外，以上結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的NKG2D受體在神經(jīng)系統(tǒng)有高度表達(dá)。為了對(duì)這些分子在中樞神經(jīng)的表達(dá)進(jìn)行定位，本研究還構(gòu)建了原位分子雜交用的探針，并進(jìn)行了初步的原位分子雜交實(shí)驗(yàn)，以及初步的Western blot和免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)。另外，為了確定Rae-1蛋白在神經(jīng)細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的分布，本研究在胚胎中提取了Rae-1RNA，逆轉(zhuǎn)錄后構(gòu)建全長(zhǎng)的真核表達(dá)質(zhì)粒，以及帶FLAG標(biāo)簽的Rae-1表達(dá)質(zhì)粒，并在Neuro2a細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究MHC-I類似分子及其受體在中樞神經(jīng)發(fā)育及正常功能中的作用打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：主要組織相容性復(fù)合體 NKG2D配體 Rae-1 Mult1 H60 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R338
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第1章 前言13-21
• 1.1 MHC- I簡(jiǎn)介13-16
• 1.1.1 MHC -I在免疫系統(tǒng)中的作用14-15
• 1.1.2 神經(jīng)系統(tǒng)中的作用15-16
• 1.2 NKG2D 及其配體16-21
• 1.2.1 NK 細(xì)胞的激活受體——NKG2D16-17
• 1.2.2 NKG2D 的配體——Rae-1，Mult1 和 H6017-21
• 第2章 帶有 FLAG 標(biāo)簽的 RAE-1 表達(dá)載體的構(gòu)建21-40
• 2.1 序言21-23
• 2.1.1 標(biāo)簽的種類和應(yīng)用21-22
• 2.1.2 重疊 PCR的原理22-23
• 2.2 材料及試劑23-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)流程25-34
• 2.3.1 提取 RNA25-26
• 2.3.2 合成鼠胚 1st-cDNA26-27
• 2.3.3 RT-PCR27-28
• 2.3.4 瓊脂糖凝膠 DNA 回收28
• 2.3.5 Rae-1基因與載體連接并轉(zhuǎn)化28-29
• 2.3.6 陽(yáng)性重組子的鑒定29
• 2.3.7 Overlap PCR29-32
• 2.3.8 雙酶切和表達(dá)載體連接32-34
• 2.4 討論34-39
• 2.5 本章結(jié)論39-40
• 第3章 ICR 小鼠中 RAE-1 亞型的表達(dá)40-44
• 3.1 序言40-41
• 3.1.1 引物的設(shè)計(jì)原則40-41
• 3.1.2 ICR 型小鼠41
• 3.2 材料與試劑41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法41-43
• 3.3.1 序列比對(duì)41-43
• 3.3.2 測(cè)序43
• 3.4 結(jié)果和討論43
• 3.5 本章結(jié)論43-44
• 第4章 MHC-Ⅰ類似分子和 NKG2D 在 ICR 鼠及細(xì)胞系的表達(dá)情況44-54
• 4.1 序言44
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料44-46
• 4.2.1 材料44-45
• 4.2.2 試劑45
• 4.2.3 器材45
• 4.2.4 培養(yǎng)基配制45-46
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法46-49
• 4.3.1 小鼠的飼養(yǎng)與繁殖46-47
• 4.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)47-48
• 4.3.4 成年鼠的灌流取腦48
• 4.3.5 胚鼠腦 RNA提取及組織包埋48-49
• 4.3.6 T-A克隆與測(cè)序49
• 4.4 結(jié)果和討論49-53
• 4.4.1 Rae-1在胚胎鼠腦，成年鼠腦及細(xì)胞系中的表達(dá)情況50
• 4.4.2 Mult1在胚胎鼠腦，成年鼠腦及細(xì)胞系中的表達(dá)情況50-51
• 4.4.3 H60在胚胎鼠腦，成年鼠腦及細(xì)胞系中的表達(dá)情況51-52
• 4.4.4 NKG2D52-53
• 4.5 本章結(jié)論53-54
• 第5章 RAE-1 在胚鼠腦中的表達(dá)變化54-62
• 5.1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR原理54-57
• 5.1.1 常用的熒光定量 PCR技術(shù)54-56
• 5.1.2 實(shí)時(shí)定量 PCR的相對(duì)定量方法56-57
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料57
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法57-59
• 5.3.1 提取組織 RNA57-58
• 5.3.2 合成 1st-cDNA58
• 5.3.3 實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量 PCR（qPCR）58-59
• 5.4 結(jié)果與討論59-61
• 5.4.1 qPCR引物檢測(cè)59-60
• 5.4.2 結(jié)果分析60-61
• 5.5 本章結(jié)論61-62
• 第6章 原位分子雜交方法檢測(cè) RAE-1 在胚胎中的表達(dá)位置62-70
• 6.1 序言62-63
• 6.1.1 原位分子雜交原理62
• 6.1.2 RNA探針的原理和特點(diǎn)62-63
• 6.2 材料與試劑63-64
• 6.3 實(shí)驗(yàn)方法64-67
• 6.3.1 制作 RNA探針64-65
• 6.3.2 制作冰凍切片65-66
• 6.3.3 雜交66-67
• 6.4 結(jié)果與討論67-70
• 第7章 RAE-1 在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)位置70-74
• 7.1 序言70-72
• 7.1.1 免疫熒光原理70-71
• 7.1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染71
• 7.1.3 N-2a 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化71-72
• 7.2 實(shí)驗(yàn)材料72
• 7.3 試驗(yàn)方法72
• 7.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72
• 7.3.2 G418篩選72
• 7.4 結(jié)果與討論72-74
• 第8章 結(jié)論74-76
• 參考文獻(xiàn)76-84
• 作者簡(jiǎn)介84-85
• 致謝85

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  本文關(guān)鍵詞：MHC-I類似分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：293067