發(fā)布時間：2020-12-15 08:07

　　目的優(yōu)化鼠疫耶爾森菌YopJ蛋白基因密碼子并在大腸埃希菌中進行異源表達純化。方法依據(jù)大腸埃希菌密碼子偏好性對鼠疫耶爾森菌YopJ基因進行全基因序列優(yōu)化,并設(shè)計引物。分別以密碼子優(yōu)化前后的鼠疫耶爾森菌YopJ蛋白的基因為模板,將包含YopJ（22aa-288aa）和YopJ（22aa-250aa）的基因片段連接到載體pGI01中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21菌株中,擴大培養(yǎng)后,IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達。提取大腸埃希菌表達蛋白并使用鎳離子柱進行純化。結(jié)果鼠疫耶爾森菌YopJ密碼子優(yōu)化前YopJ（22aa-288aa）及YopJ（22aa-250aa）在大腸埃希菌內(nèi)表達水平較低,密碼子優(yōu)化后YopJ（22aa-288aa）及YopJ（22aa-250aa）在大腸埃希菌內(nèi)大量表達可溶性YopJ蛋白。結(jié)論對鼠疫耶爾森菌YopJ蛋白進行基因密碼子優(yōu)化能夠提高其在大腸埃希菌內(nèi)的表達量。獲得的鼠疫耶爾森菌YopJ蛋白具有可溶性,為進一步研究其結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019年09期 北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

圖１密碼子優(yōu)化前鼠疫耶爾森菌ＹｏｐＪＤＮＡ序列Ｆｉｇ．１ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＹｅｒｓｉｎｉａＹｏｐＪｂｅｆｏｒｅｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

ｆ、ｗ、ｅ進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測。結(jié)果１密碼子優(yōu)化前后鼠疫耶爾森菌ＹｏｐＪ基因序列比較密碼子優(yōu)化前后鼠疫耶爾森菌ＹｏｐＪ基因序列見圖１和圖２。根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性，對ＹｏｐＪ的ＤＮＡ序列進行優(yōu)化，保持氨基酸的序列不變，替換了１７４個堿基。圖１密碼子優(yōu)化前鼠疫耶爾森菌ＹｏｐＪＤＮＡ序列Ｆｉｇ．１ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＹｅｒｓｉｎｉａＹｏｐＪｂｅｆｏｒｅｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ圖２密碼子優(yōu)化后鼠疫耶爾森菌ＹｏｐＪＤＮＡ序列Ｆｉｇ．２ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＹｅｒｓｉｎｉａＹｏｐＪａｆｔｅｒｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ２目的基因的鑒定用密碼子優(yōu)化前后各兩組引物分別將鼠疫耶爾森菌ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａ基因及ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因進行擴增，將ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小分別８０１ｂｐ和６８７ｂｐ（圖３）。３重組蛋白的鑒定將含有重組質(zhì)粒的表達菌分別接種到ＬＢ培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，當Ａ６００值為０．６～０．８時，１６℃降溫１ｈ，加入ＩＰＴＧ低溫誘導(dǎo)過夜，離心收集菌，破碎，離心得到可溶蛋白，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，ＹｏｐＪ蛋白相對分子質(zhì)量約為３２×１０３。其中密碼子優(yōu)化前ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａ基因無可溶性ＹｏｐＪ蛋白表達，ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因表達可溶性ＹｏｐＪ蛋白的量較少（圖４）。密碼子優(yōu)化后兩組基因可溶性

ＹｏｐＪ蛋白表達，ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因表達可溶性ＹｏｐＪ蛋白的量較少（圖４）。密碼子優(yōu)化后兩組基因可溶性ＹｏｐＪ蛋白表達水平較密碼子優(yōu)化前有顯著提升（圖５）。ＭＤＮＡ標志物（ＤＬ２００）１優(yōu)化前ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａ基因ＰＣＲ產(chǎn)物２優(yōu)化前ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因ＰＣＲ產(chǎn)物３優(yōu)化后ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａ基因ＰＣＲ產(chǎn)物４優(yōu)化后ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因ＰＣＲ產(chǎn)物圖３ＰＣＲ擴增目的基因片段ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａｇｅｎｅｂｅｆｏｒｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ２ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａｇｅｎｅｂｅｆｏｒｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ３ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａｇｅｎｅａｆｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ４ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａｇｅｎｅａｆｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＦｉｇ．３ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ·６０１０·中國病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年９月第１４卷第９期Ｓｅｐ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．９


本文編號：2917954