發(fā)布時(shí)間：2020-12-14 16:41

　　目的構(gòu)建編碼腸道病毒71型（EV71）3D聚合酶基因的重組質(zhì)粒,表達(dá)和純化3D聚合酶并檢測(cè)其活性。方法將編碼3D聚合酶的基因片段克隆至pGEX-4T-1原核表達(dá)載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21（DE3）,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖親和層析、TEV酶酶切、Ni-NTA柱親和純化后獲得高純度3D聚合酶蛋白,放射測(cè)量法是體外酶活力測(cè)定方法中較常見(jiàn)的一種方法,本研究通過(guò)測(cè)定插入poly（U） RNA放射性標(biāo)志UMP的量確定3D聚合酶的活性。結(jié)果經(jīng)酶切、PCR、測(cè)序鑒定pGEX-4T-3D重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,3D聚合酶基因片段大小為1 386 bp。與未誘導(dǎo)相比,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后帶有GST標(biāo)簽的3D聚合酶成功表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量約為79×10³,TEV酶酶切掉GST標(biāo)簽后的相對(duì)分子質(zhì)量約為55×10³。純化的3D聚合酶經(jīng)體外延伸反應(yīng)后跑變性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳得知,3D聚合酶溶解液DMSO組相比于3D聚合酶強(qiáng)抑制劑EDTA組,在DMSO組中,可以觀察到強(qiáng)電泳條帶,表明放射性同位素標(biāo)志程度強(qiáng),表明反應(yīng)速率快,即3D聚合酶酶活較好。結(jié)... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2019年09期 北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【圖文】：

圖１３Ｄ聚合酶基因ＰＣＲ擴(kuò)增１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）２３Ｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｇｅｎｅ１ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ２０００）

１００００ｇ離心３０ｍｉｎ后取上清液，經(jīng)１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳鑒定，３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中成功表達(dá)，其相對(duì)分子質(zhì)量為７９×１０３（圖３）。３３Ｄ聚合酶的純化３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中可溶性表達(dá)，主要存在于裂解液上清。重組菌裂解液經(jīng)柱層析純化后得到純度較高的帶有ＧＳＴ標(biāo)簽的３Ｄ蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為７９×１０３左右（圖４）。１ＤＮＡ標(biāo)志物２ｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ雙酶切圖２重組質(zhì)粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－３Ｄ酶切鑒定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２Ｄｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１重組菌ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物２重組菌未誘導(dǎo)對(duì)照?qǐng)D３重組３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中的表達(dá)鑒定ＭＭａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１ＩｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ２ＵｎｉｎｄｕｃｅｄＦｉｇ．３ＩＰＴＧｉｎｄｕｃｉｎｇ３ＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢＬ２１１蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)２重組菌未誘導(dǎo)３重組菌ＩＰＴＧ誘導(dǎo)菌體４重組菌ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后破碎上清５重組菌ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后破碎沉淀６過(guò)柱收集液７ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第１次收集液８ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第２次收集液９ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第３次收集液１０ＴＥＶ酶切后收集液圖

７９×１０３左右（圖４）。１ＤＮＡ標(biāo)志物２ｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ雙酶切圖２重組質(zhì)粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－３Ｄ酶切鑒定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２Ｄｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１重組菌ＩＰＴＧ誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物２重組菌未誘導(dǎo)對(duì)照?qǐng)D３重組３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中的表達(dá)鑒定ＭＭａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１ＩｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ２ＵｎｉｎｄｕｃｅｄＦｉｇ．３ＩＰＴＧｉｎｄｕｃｉｎｇ３ＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢＬ２１１蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)２重組菌未誘導(dǎo)３重組菌ＩＰＴＧ誘導(dǎo)菌體４重組菌ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后破碎上清５重組菌ＩＰＴＧ誘導(dǎo)后破碎沉淀６過(guò)柱收集液７ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第１次收集液８ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第２次收集液９ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第３次收集液１０ＴＥＶ酶切后收集液圖４１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析純化帶ＧＳＴ標(biāo)簽３Ｄ聚合酶１Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）２Ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ３ＴｈｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｄｕｃｅｄｗｉｈＩＰＴＧ４ＴｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ５Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ６Ｔｈｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｂｉｎｄｉｎｇｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈｃｏｌｕｍｎ７Ｔｈｅｆｉｒ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]腫瘤抑制蛋白APC與Amer1的結(jié)合機(jī)理研究[D]. 肖亞飛.上海交通大學(xué) 2014



本文編號(hào)：2916675