目的構(gòu)建編碼腸道病毒71型（EV71）3D聚合酶基因的重組質(zhì)粒,表達和純化3D聚合酶并檢測其活性。方法將編碼3D聚合酶的基因片段克隆至pGEX-4T-1原核表達載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21（DE3）,IPTG誘導表達,經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖親和層析、TEV酶酶切、Ni-NTA柱親和純化后獲得高純度3D聚合酶蛋白,放射測量法是體外酶活力測定方法中較常見的一種方法,本研究通過測定插入poly（U） RNA放射性標志UMP的量確定3D聚合酶的活性。結(jié)果經(jīng)酶切、PCR、測序鑒定pGEX-4T-3D重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,3D聚合酶基因片段大小為1 386 bp。與未誘導相比,經(jīng)IPTG誘導后帶有GST標簽的3D聚合酶成功表達,表達產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量約為79×10³,TEV酶酶切掉GST標簽后的相對分子質(zhì)量約為55×10³。純化的3D聚合酶經(jīng)體外延伸反應后跑變性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳得知,3D聚合酶溶解液DMSO組相比于3D聚合酶強抑制劑EDTA組,在DMSO組中,可以觀察到強電泳條帶,表明放射性同位素標志程度強,表明反應速率快,即3D聚合酶酶活較好。結(jié)... 

【文章來源】：中國病原生物學雜志. 2019年09期 北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【圖文】：

圖１３Ｄ聚合酶基因ＰＣＲ擴增１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）２３Ｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｇｅｎｅ１ＤＮＡ標志物（ＤＬ２０００）

１００００ｇ離心３０ｍｉｎ后取上清液，經(jīng)１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳鑒定，３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中成功表達，其相對分子質(zhì)量為７９×１０３（圖３）。３３Ｄ聚合酶的純化３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中可溶性表達，主要存在于裂解液上清。重組菌裂解液經(jīng)柱層析純化后得到純度較高的帶有ＧＳＴ標簽的３Ｄ蛋白，其相對分子質(zhì)量為７９×１０３左右（圖４）。１ＤＮＡ標志物２ｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ雙酶切圖２重組質(zhì)粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－３Ｄ酶切鑒定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２Ｄｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ蛋白分子質(zhì)量標準１重組菌ＩＰＴＧ誘導表達產(chǎn)物２重組菌未誘導對照圖３重組３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中的表達鑒定ＭＭａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１ＩｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ２ＵｎｉｎｄｕｃｅｄＦｉｇ．３ＩＰＴＧｉｎｄｕｃｉｎｇ３ＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢＬ２１１蛋白分子質(zhì)量標準２重組菌未誘導３重組菌ＩＰＴＧ誘導菌體４重組菌ＩＰＴＧ誘導后破碎上清５重組菌ＩＰＴＧ誘導后破碎沉淀６過柱收集液７ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第１次收集液８ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第２次收集液９ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第３次收集液１０ＴＥＶ酶切后收集液圖

７９×１０３左右（圖４）。１ＤＮＡ標志物２ｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ雙酶切圖２重組質(zhì)粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－３Ｄ酶切鑒定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２Ｄｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ蛋白分子質(zhì)量標準１重組菌ＩＰＴＧ誘導表達產(chǎn)物２重組菌未誘導對照圖３重組３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中的表達鑒定ＭＭａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１ＩｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ２ＵｎｉｎｄｕｃｅｄＦｉｇ．３ＩＰＴＧｉｎｄｕｃｉｎｇ３ＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢＬ２１１蛋白分子質(zhì)量標準２重組菌未誘導３重組菌ＩＰＴＧ誘導菌體４重組菌ＩＰＴＧ誘導后破碎上清５重組菌ＩＰＴＧ誘導后破碎沉淀６過柱收集液７ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第１次收集液８ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第２次收集液９ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ沖洗第３次收集液１０ＴＥＶ酶切后收集液圖４１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析純化帶ＧＳＴ標簽３Ｄ聚合酶１Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）２Ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ３ＴｈｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｄｕｃｅｄｗｉｈＩＰＴＧ４ＴｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ５Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ６Ｔｈｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｂｉｎｄｉｎｇｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈｃｏｌｕｍｎ７Ｔｈｅｆｉｒ

【參考文獻】：
期刊論文
[1]腸道病毒71型3D聚合酶轉(zhuǎn)錄激活域的界定[J]. 徐驍,姚云芳,李靖,柴克莉,喬文濤,談娟.  病毒學報. 2016(05)
[2]線粒體自噬受體Bnip3的載體構(gòu)建及蛋白表達純化[J]. 張玲莉,張星亮.  生物技術. 2015(04)
[3]蛋白激酶的生化活性檢測方法研究進展[J]. 李玥,李會娟,高芳,王田,毛偉峰.  生命的化學. 2014(05)
[4]沙門氏菌硫修飾基因dptC的克隆表達與分離純化[J]. 安賢惠,周秀芬,汪志軍,鄧子新,梁晶丹.  微生物學報. 2013(10)
[5]放射性同位素標記法檢測脂蛋白脂肪酶活性及其應用[J]. 張愛宏,劉國慶.  中國動脈硬化雜志. 2003(06)
[6]放射性同位素標記測定RNA N-糖苷酶活性的新方法[J]. 王喜萍,劉望夷,王鳴歧.  生物化學與生物物理進展. 1990(06)

碩士論文
[1]腫瘤抑制蛋白APC與Amer1的結(jié)合機理研究[D]. 肖亞飛.上海交通大學 2014



本文編號：2916675