目的在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)下,觀察SCAP/SREBP-1c對肝細胞脂質(zhì)合成代謝的影響。方法用毒胡蘿卜素（Tg）誘導人L02正常肝細胞株建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型,Western blot檢測GRP78的蛋白表達。甘油三酯（TG）試劑盒和油紅O染色檢測肝細胞內(nèi)脂變程度;實時熒光定量PCR檢測SREBP-1c下游脂代謝相關(guān)基因FAS、ACC1的mRNA表達情況,Western blot檢測n SREBP-1c、FAS、ACC1的蛋白表達情況。通過miRNA瞬時轉(zhuǎn)染沉默SCAP基因的表達,觀察上述指標的變化情況。結(jié)果實驗組GRP78蛋白的相對表達量與對照組比較,均顯著增加（P<0.05）,Tg在體外成功建立肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型。與空白對照組相比,Tg組肝細胞內(nèi)甘油三酯含量明顯增加（P<0.05）,脂滴明顯增多;n SREBP-1c的蛋白水平明顯升高（P<0.05）;下游靶基因FAS和ACC1的基因和蛋白水平均明顯上調(diào)（P<0.05）,與n SREBP-1c的升高趨勢一致。轉(zhuǎn)染SCAP-3 miRNA載體后,以上指標均明顯下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過SCAP/SR... 

【文章來源】：第三軍醫(yī)大學學報. 2015年05期 第443-448頁 北大核心

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Westernblot檢測各組L02肝細胞GＲP78蛋白的表達

0、12、24、48h圖1Westernblot檢測各組L02肝細胞GＲP78蛋白的表達2．2Westernblot檢測SCAP-miＲNA對SCAP蛋白表達的影響與空白對照組的SCAP相對表達量(0．61±0．03)比較，陰性對照組(0．63±0．03)差異無顯著性(P＞0.05)，而轉(zhuǎn)染SCAP-3miＲNA(0．09±0．01)對SCAP蛋白表達的抑制作用最明顯(P＜0．05)，因此在后續(xù)的實驗中我們選用SCAP-3miＲNA。各組SCAP蛋白表達見圖2。12345SCAP（150×103）→β螄actin（43×103）→1:空白對照組;2:陰性質(zhì)粒對照組;3:SCAP-1miＲNA;4:SCAP-2miＲNA;5:SCAP-3miＲNA圖2Westernblot檢測各組L02肝細胞SCAP蛋白的表達2．3SCAP-3miＲNA對EＲS狀態(tài)下L02肝細胞甘油三酯含量的影響Tg組和空白對照組相比，L02肝細胞內(nèi)甘油三酯含量明顯增加(P＜0．05)，表明EＲS可誘導肝細胞脂肪變性。與Tg組相比較，陰性質(zhì)粒組的甘油三酯水平并沒有明顯改變(P＞0．05);而SCAP干擾質(zhì)粒組的甘油三酯水平明顯降低(P＜0．05)。說明干擾SCAP基因的表達，明顯減少了肝細胞的甘油三酯合成，改善了EＲS引起的脂肪變。各組肝細胞甘油三酯含量見表1。表1各組L02肝細胞內(nèi)甘油三酯含量(μg/mg，n=3，x珋±s)組別L02細胞空白對照組23．44±1．63Tg組39．35±1．71aSCAP陰性質(zhì)粒+Tg組41．11±2．41SCAP干擾質(zhì)粒+Tg組28．12±1．29ba:P＜0．05，與空白對照組比較;b:P＜0．05，與Tg組比較2．4SCAP-3miＲNA對EＲS狀態(tài)下L02肝細胞內(nèi)脂滴的影響Tg組與空白對照組相比較，L02肝細胞內(nèi)可見大量紅色脂滴，并伴有脂滴融合現(xiàn)象，進一步說明我們的EＲS模型誘導了肝細胞脂肪變性。與Tg組相比較，陰性質(zhì)粒組細胞內(nèi)脂滴未見明顯減少，而SCAP干擾質(zhì)粒組細胞內(nèi)僅見少量紅色脂滴，說明干擾SCAP明顯減輕了EＲS所致的脂肪沉積

CDABA:空白對照組;B:Tg組;C:陰性質(zhì)粒+Tg組;D:干擾質(zhì)粒+Tg組圖3油紅O染色觀察各組L02肝細胞內(nèi)脂滴變化(×200)2．5SCAP-3miＲNA對EＲS狀態(tài)下L02肝細胞內(nèi)SＲEBP-1c下游脂代謝相關(guān)基因FAS、ACC1mＲNA表達的影響在mＲNA水平，以空白對照組的表達為1，經(jīng)Tg處理48h后，L02肝細胞的FAS、ACC1的相對表達量明顯增加(P＜0．05)。與Tg組相比較，轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒后，兩者并沒有明顯改變(P＞0．05);而轉(zhuǎn)染SCAP-3miＲNA干擾質(zhì)粒后，兩者均明顯減少(P＜0．05)。見圖4。以上結(jié)果提示了EＲS上調(diào)SＲEBP-1c下游的脂代謝相關(guān)基因FAS、ACC1的mＲNA表達水平，而且SCAP-3miＲNA能下調(diào)EＲS所致的以上指標的變化。151050FASmRNA相對表達1234ab3210ACC1mRNA相對表達1234ab髿鬀組別組別1:空白對照組;2:Tg組;3:陰性質(zhì)粒+Tg組;4:干擾質(zhì)粒+Tg組a:P＜0．05，與空白對照組比較;b:P＜0．05，與Tg組比較圖4實時熒光定量PCＲ法檢測各組L02肝細胞FAS(A)、ACC1(B)的mＲNA表達2．6SCAP-3miＲNA對EＲS狀態(tài)下L02肝細胞內(nèi)nSＲEBP-1c、FAS、ACC1蛋白表達的影響在蛋白水平，Tg組與對照組相比，L02肝細胞nSＲEBP-1c蛋白的表達明顯升高(P＜0．05);轉(zhuǎn)染SCAP干擾質(zhì)粒后，nSＲEBP-1c蛋白的表達明顯降低(P＜0．05)，而陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組并沒有明顯降低(P＞0．05)。同時，我們檢測了各組肝細胞FAS、ACC1蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)Tg組FAS、ACC1表達顯著上調(diào)(P＜0．05)，在轉(zhuǎn)染后亦明顯降低(P＜0．05)，陰性質(zhì)粒組均無明顯改變(P＞0．05)，與nSＲEBP-1c蛋白趨勢一致(圖5，表2)。結(jié)果證實，干擾SCAP，不僅能抑制EＲS狀態(tài)所引起的nSＲEBP-1c蛋白的表達增多，而且能夠下調(diào)其下游的脂代謝相關(guān)基因FAS、ACC1的

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：2900653