發(fā)布時(shí)間：2017-04-07 07:03

  本文關(guān)鍵詞：XPD對(duì)ox-LDL促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的: 本研究在首先發(fā)現(xiàn)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)表達(dá)剪切修復(fù)基因D（xeroderma pigmentosum D，XPD）的基礎(chǔ)上，以氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，觀察XPD在血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時(shí)的表達(dá)；同時(shí)沉默內(nèi)皮細(xì)胞XPD基因的表達(dá)后，觀察ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況，探討XPD-siRNA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。 方法： 1、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)XPD mRNA表達(dá)。 2、以氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，培養(yǎng)基中ox-LDL終濃度分別為50μg/m l、100μg/m l、150μg/m l、200μg/m l，孵育24小時(shí)。通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，篩選ox-LDL最佳作用濃度，建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型。 3、用Western Blottig檢測(cè)經(jīng)ox-LDL處理的HUVEC中XPD的蛋白表達(dá)變化。 4、設(shè)計(jì)并化學(xué)合成3對(duì)靶向XPD的siRNA，，即XPD-siRNA-1、XPD-siRNA-2、XPD-siRNA-3，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HUVEC。通過(guò)Western Blotting檢測(cè)XPD蛋白的表達(dá)，篩選出最佳干擾序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 5、將最佳干擾序列轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，并經(jīng)最佳濃度的ox-LDL孵育24小時(shí)。將實(shí)驗(yàn)分6組：a.空白對(duì)照組；b.陰性對(duì)照siRNA組；c. XPD-siRNA組；d.ox-LDL組；e. ox-LDL+陰性對(duì)照siRNA組；f. ox-LDL+XPD-siRNA組。 6、用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞的存活率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率；提取各組細(xì)胞的蛋白通過(guò)Western Blottig檢測(cè)XPD、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況；提取各組細(xì)胞的RNA通過(guò)RT-PCR檢測(cè)XPD、Bcl-2和Bax基因的表達(dá)情況。 7、統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人剪切修復(fù)基因D（XPD）。 2、濃度為50～200μg/ml的ox-LDL作用HUVEC24h，均能破壞其活力與凋亡之間的平衡，其中100μg/ml為最佳作用濃度。 2、XPD在經(jīng)不同濃度ox-LDL處理的HUVEC中表達(dá)均增加。 3、3對(duì)XPD-siRNA均能有效抑制HUVEC中XPD的表達(dá)，其中以XPD-siRNA-2沉默效率最高,為（76.15±2.14）%。 4、MTT結(jié)果顯示， XPD-siRNA組的細(xì)胞活力較空白對(duì)照組增加（140.43±4.26VS100, p0.05），ox-LDL+XPD-siRNA組的細(xì)胞活力較ox-LDL+陰性對(duì)照siRNA組明顯增加（110.91±3.22VS70.58±4.67, p0.05）。 5、流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示，XPD-siRNA組的細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組降低（2.0±0.30VS5.17±0.16, p0.05），ox-LDL+XPD-siRNA組的細(xì)胞凋亡率較ox-LDL+陰性對(duì)照siRNA組明顯降低（15.26±0.74VS28.32±0.63, p0.05）。 6、RT-PCR和Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，XPD-siRNA組XPD表達(dá)降低，分別為（0.11±0.01VS0.32±0.01, p0.05）和（0.1±0.0.01VS0.49±0.0.01, p0.05）；Bcl-2表達(dá)增高，分別為（0.35±0.02VS0.15±0.02, p0.05）和（0.24±0.0.02VS0.07±0.02, p0.05）；Bax表達(dá)降低，分別為（0.1±0.01VS0.53±0.02, p0.05）和（0.07±0.01VS0.37±0.02, p0.05）。 7、RT-PCR和Western Blotting結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與ox-LDL+陰性對(duì)照siRNA組相比，ox-LDL+XPD-siRNA組XPD表達(dá)降低，分別為（0.45±0.02VS0.65±0.01,p0.05）和（0.25±0.0.01VS1.06±0.01, p0.05）；Bcl-2表達(dá)增高，分別為（0.24±0.02VS0.09±0.06, p0.05）和（0.15±0.01VS0.04±0.00, p0.05）；Bax表達(dá)降低，分別為（0.49±0.03VS0.89±0.01, p0.05）和（0.19±0.01VS0.83±0.01, p0.05）。 結(jié)論： 1、XPD在HUVEC中有表達(dá)，ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC表達(dá)XPD基因上調(diào)。 2、XPD介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡。 3、XPD介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡的可能機(jī)制與Bax和Bcl-2表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：剪切修復(fù)基因XPD 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 ox-LDL 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 引言10-11
• 第2章 材料與方法11-25
• 2.1 材料11-15
• 2.1.1 細(xì)胞株11
• 2.1.2 主要試劑11-12
• 2.1.3 自配試劑12-14
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備14-15
• 2.2 方法15-25
• 2.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)15-16
• 2.2.2 RT-PCR 檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中 XPD 的基因表達(dá)16
• 2.2.3 建立 ox-LDL 促內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型16-17
• 2.2.4 Western Blottig 檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型中 XPD 的表達(dá)變化17
• 2.2.5 設(shè)計(jì)與合成靶向 XPD 的 siRNA 序列17-18
• 2.2.6 內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染18-19
• 2.2.7 MTT 法測(cè)定細(xì)胞活力19
• 2.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率19
• 2.2.9 Western Blotting 檢測(cè) XPD、Bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá)19-22
• 2.2.10 RT-PCR 檢測(cè) XPD、Bcl-2、Bax 基因的表達(dá)22-24
• 2.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24-25
• 第3章 結(jié)果25-31
• 3.1 XPD 在 HUVEC 中基因表達(dá)25
• 3.2 不同濃度的 ox-LDL 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響25-26
• 3.3 XPD 在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型中的表達(dá)變化26
• 3.4 篩選最佳 XPD-siRNA26-27
• 3.5 XPD-siRNA 和 ox-LDL 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞存活率和凋亡率的影響27-28
• 3.6 XPD-siRNA 和 ox-LDL 對(duì) XPD、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響28-29
• 3.7 XPD-siRNA 和 ox-LDL 對(duì) XPD、Bcl-2、Bax 基因表達(dá)的影響29-31
• 第4章 討論31-37
• 4.1 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與心血管疾病31-32
• 4.2 靶向 XPD 的最佳 siRNA 的篩選32-33
• 4.3 XPD 與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡33-34
• 4.4 XPD-siRNA 抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制34-37
• 第5章 結(jié)論37-38
• 1、XPD 在 HUVEC 中有表達(dá)37
• 2、XPD 介導(dǎo) ox-LDL 誘導(dǎo) HUVEC 凋亡37
• 3、XPD 介導(dǎo) ox-LDL 誘導(dǎo) HUVEC 凋亡的可能機(jī)制與 Bax 和 Bcl-2 表達(dá)有關(guān)37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果43-44
• 綜述44-51
• 參考文獻(xiàn)49-51

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;XPD Lys751Gln polymorphism and esophageal cancer risk: A meta-analysis involving 2288 cases and 4096 controls[J];World Journal of Gastroenterology;2011年18期

  本文關(guān)鍵詞：XPD對(duì)ox-LDL促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：289861