本文關(guān)鍵詞：重組人來源的IL4在畢赤酵母中的表達(dá)及其糖基化與其生物活性的關(guān)系，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：人IL4是一種外分泌糖蛋白,具有抗腫瘤、抗炎作用,在某些炎癥和自身免疫病中具有潛在的應(yīng)用價值,可能成為防治自身免疫性糖尿病的藥物。但是,應(yīng)用單劑量的IL4有發(fā)熱、惡心嘔吐、鼻充血、腹瀉、厭食、體重增加和呼吸困難等副反應(yīng)。I期臨床試驗表明靜脈注射最大耐受劑量的IL4,并未觀察到治療作用,單獨使用IL4沒有明顯的抗腫瘤作用,而合用其他制劑可見肺轉(zhuǎn)移腫瘤明顯轉(zhuǎn)歸。之前的研究幾乎是基于原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來源的重組IL4,沒有經(jīng)過翻譯后糖基化修飾,這是否是造成IL4臨床治療受限的原因呢?近幾年來,重組蛋白技術(shù)及其臨床應(yīng)用受到廣泛關(guān)注,真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如畢赤酵母能夠成功表達(dá)分泌糖基化修飾的人源性重組蛋白,但是,糖基化對蛋白質(zhì)本身生物學(xué)活性與功能的影響是怎么的呢,目前在學(xué)術(shù)界尚無定論。重組人源性IL4在畢赤酵母中表達(dá)及其糖基化與生物學(xué)功能是否有直接關(guān)系,每個糖基化位點的貢獻(xiàn)是否一致,在國內(nèi)至今尚無有關(guān)這方面的研究。本課題旨在研究重組人來源的糖基化蛋白在畢赤酵母真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及糖基化與其生物學(xué)功能的關(guān)系。 研究目的：旨在研究畢赤酵母真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中人來源IL4糖基化蛋白的表達(dá),明確糖基化對其蛋白的生物學(xué)功能的影響,為重組蛋白在臨床疾病治療中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。研究方法：用PCR方法擴(kuò)增人全長IL4cDNA,PCR產(chǎn)物回收,DNA序 列分析后克隆至酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA(Invitrogen,USA)Xho1/Xbal位點,pPICZa-IL4并轉(zhuǎn)染E.coli(TOP1OF,strain),表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功后,將SacI酶切的線性質(zhì)粒用酵母轉(zhuǎn)染試劑盒(Pichia Easycom Transformation Kit, Invitrogen, USA)轉(zhuǎn)染畢赤酵母X-33細(xì)胞,表達(dá),純化,-80度保存。SDS-PAGE和western blotting分別檢測IL4表達(dá)情況。N-glycanase (PNGase F, New England BioLabs)處理IL4,并用點突變法分別突變?nèi)嗽葱訧L4糖基化位點Asn38和Asn105位,制備質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染畢赤酵母細(xì)胞,表達(dá),純化,-80度保存,分別用SDS-PAGE和western blotting檢測IL4糖基化情況,并用質(zhì)譜進(jìn)一步證實Asn105位糖基化情況。提取的C57BL/6鼠脾細(xì)胞,磁珠分選,收集CD19+脾細(xì)胞,分為糖基化IL4組和去糖基化IL4組,用重組人源性IL4處理,37度共孵育16小時后流式檢測CD23表達(dá)情況。糖基化IL4組和去糖基化IL4組,細(xì)胞外分泌IL4和胞內(nèi)提取IL4分別在4度、室溫、37度孵育3天、7天、10天,用western blotting檢測。 研究結(jié)果：人源性糖基化蛋白IL4在真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母細(xì)胞中高表達(dá),并分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中,SDS-PAGE和western blotting結(jié)果顯示相對分子量約為34-50kDa的IL4分泌量逐漸增多并與96小時后下降。用PNGase F處理后IL4分子量和對照組相比明顯減小,約為15kDa。經(jīng)過純化后獲得高純度的IL4蛋白。N38A, N105L突變體DNA序列分析結(jié)果顯示突變正確。western blotting結(jié)果顯示N38A突變株分泌蛋白分子量明顯減小,降至約15kDa,而N105L突變株分泌蛋白分子量無變化,仍為34-50kDa。質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步顯示N105L突變株分泌蛋白沒有發(fā)生糖基化。IL4生物活性檢測結(jié)果顯示,糖基化IL4和去糖基化IL4組B細(xì)胞CD23表達(dá)均上調(diào),但是,和糖基化IL4組相比去糖基化IL4組上調(diào)B細(xì)胞CD23表達(dá)更明顯(p0.01)。蛋白穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示非糖基化IL4無論細(xì)胞內(nèi)、外均較糖基化IL4穩(wěn)定,而糖基化IL4組,細(xì)胞內(nèi)外蛋白穩(wěn)定性相比,外分泌部分較胞內(nèi)部分更穩(wěn)定。 結(jié)論： (1).真核細(xì)胞畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),能夠成功表達(dá)糖基化蛋白rhIL4。 (2).Asn38是rhIL4唯一的N-糖基化位點。 (3)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的糖基化蛋白rhIL4具有生物學(xué)功能。 (4).非糖基化rhIL4生物活性和蛋白穩(wěn)定性更高。
【關(guān)鍵詞】：N-糖基化 重組人IL4 點突變 畢赤酵母
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• CATALOGUE5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 符號說明12-14
• 前言14-18
• 材料與方法18-26
• 結(jié)果26-28
• 討論28-41
• 小結(jié)41-42
• 附圖42-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 致謝54-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文55-56
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表56

【共引文獻(xiàn)】

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3 仲偉磊;引入新的二硫鍵對植酸酶結(jié)構(gòu)和功能的影響[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

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  本文關(guān)鍵詞：重組人來源的IL4在畢赤酵母中的表達(dá)及其糖基化與其生物活性的關(guān)系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：289303