目的：堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF） 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起到促進(jìn)增生、分化的重要作用，可促進(jìn)各類神經(jīng)移植物的存活和/或功能發(fā)揮。此外，bFGF還保護(hù)神經(jīng)元免受各種損傷因素及興奮性氨基酸的損傷。已有大量文獻(xiàn)報道了應(yīng)用外源性bFGF可以減少缺血缺氧造成的實驗動物腦梗死面積或促進(jìn)梗死損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。上述實驗均從梗死面積的測定以及動物整體行為功能測定方面描述了外源性bFGF的重要作用。bFGF作為腦內(nèi)含量最高的一類生長因子其含量可以達(dá)到40~50(g/Kg。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種細(xì)胞可以表達(dá)bFGF，但其主要來源于星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes, As）。在腦組織受到各種損傷的情況下As可以活化分泌bFGF增加。缺血性損傷后內(nèi)源性bFGF的表達(dá)有無變化？為什么缺血損傷后內(nèi)源性的bFGF不能有效發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用？外源性bFGF進(jìn)入腦內(nèi)對內(nèi)源性bFGF表達(dá)有無影響？均尚未有實驗探究。我們試圖在明確缺血損傷后內(nèi)源性bFGF在腦內(nèi)各種細(xì)胞中的動態(tài)表達(dá)及其與自身受體表達(dá)的相互關(guān)系的基礎(chǔ)上，為闡明外源性bFGF應(yīng)用缺血性損傷治療的原因及機(jī)制提供實驗依據(jù)。 Egr-1(egrly growth response protein 1)能夠與bFGF基因啟動子結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性。NAB2(NGFI-A binding protein 2)蛋白被認(rèn)為是Egr-1的特異性抑制因子。腦缺血缺氧損傷后是否有Egr-1蛋白及NAB2參與bFGF的表達(dá)未見報導(dǎo)。bFGF作為硫酸肝素類結(jié)合分子，有雙重受體系統(tǒng)：細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸肝素蛋白多糖的低親和力受體及多種細(xì)胞膜表面上的高親和力受體。bFGF與高親和受體結(jié)合后啟動了多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，其中MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最值得關(guān)注， bFGF的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Egr-1也受到MAPK信號通路的調(diào)控。外源性bFGF作用于缺血損傷細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及對自身表達(dá)的影響尚未見研究報告。 缺血損傷后血腦屏障受損乃至通透性改變的報道各家不一，對bFGF的通透性更無專門的報告。因而早期應(yīng)用外源性bFGF治療缺血性損傷就具有了一定的盲目性。 本課題試圖通過闡明缺血損傷對內(nèi)源性bFGF及受體表達(dá)的影響；外源性bFGF對缺血缺氧細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制及對內(nèi)源性bFGF表達(dá)的影響以及腦缺血損傷后外源性bFGF用藥窗口等問題為bFGF應(yīng)用臨床治療腦缺血提供實驗與理論依據(jù)。 WP=6 方法：采用大鼠持續(xù)性大腦中動脈栓塞模型（permantent middle cerebral artery occlusion, pMCAO），應(yīng)用免疫組化，western-blot, RT-PCR等方法系統(tǒng)觀察了大鼠腦持續(xù)性局灶性缺血損傷后自0.5h起到14d神經(jīng)元和As等細(xì)胞表達(dá)Egr-1、bFGF蛋白及bFGF特異性的高親和力受體bFGFR的動態(tài)變化。 用體外原代培養(yǎng)的As的缺血缺氧模型，采用western-blot、免疫熒光雙標(biāo)記的方法觀察了Egr-1、NAB2蛋白表達(dá)的動態(tài)變化并采用凝膠電泳遷移率變動分析（EMSA）分析了Egr-1與bFGF啟動子結(jié)合能力的動態(tài)變化。 在體外原代培養(yǎng)的As的缺氧－給氧損傷后，采用western-blot檢測了體外缺氧－給氧損傷后外源性bFGF對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中raf-MEK-ERK中MEK-1、ERK-1/2蛋白表達(dá)水平、ERK磷酸化水平及SAPK/JNK 通路中JNK磷酸化程度影響。并采用EMSA分別檢測分析了缺氧－給氧損傷、缺氧－給氧損傷并給予bFGF對Egr-1蛋白活性的影響，以明確在缺氧損傷后外源性bFGF對內(nèi)源性bFGF表達(dá)的影響，并在給予bFGF后加入MEK的特異性抑制劑U0126 后檢測Egr-1的活性，分析了其與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。 采用抗BBB抗體免疫組化方法顯示了pMCAO 后不同時段BBB結(jié)構(gòu)的改變。采用125I標(biāo)記bFGF 的放射標(biāo)記示蹤的方法對pMCAO后靜脈應(yīng)用bFGF通透血腦屏障的時間窗口進(jìn)行了探討。 結(jié)果： 體內(nèi) 實驗發(fā)現(xiàn)在pMCAO損傷后，應(yīng)用半定量RT-PCR顯示在缺血梗死損傷后0.5h bFGFmRNA就開始增加，持續(xù)到損傷后1天（p0.05），免疫組化見缺血 bFGF表達(dá)出現(xiàn)雙相增強(qiáng)，分別是缺血1h及缺血后6h~1d時缺血邊緣區(qū)bFGF染色增強(qiáng)，主要見于As，表現(xiàn)為胞漿、胞突及細(xì)胞核陽性增強(qiáng)，神經(jīng)元細(xì)胞核反應(yīng)亦增強(qiáng)，但始終弱于As。與免疫組化不同的是western-blot顯示僅在缺血后12h~2d時分子量為18kDa bFGF含量明顯增加（p0.05）， 22 kDa的bFGF僅在缺氧后1d表達(dá)增強(qiáng)，24 kDa的bFGF僅在缺氧后2d時表達(dá)增強(qiáng)，未見缺血1h有任何分子量bFGF含量的增加。 半定量RT-PCR顯示bFGFRmRNA在pMCAO后0.5h開始升高(P0.05)，持續(xù)到pMCAO后2h，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)bFGFR在2～6h明顯增強(qiáng)。bFGFRmRNA 及蛋白表達(dá)均早于bFGFmRNA 和蛋白的表達(dá)高峰。 免疫組化及western-blot顯示缺血后1h~6h時Egr-1蛋白表達(dá)增加。 在體外原代培養(yǎng)的As缺血缺氧模型上測得損傷后0.5～4h Egr-1蛋白表達(dá)明顯升高（P0.05），6h迅速回落降低到正常水平。與Egr-1蛋白表達(dá)規(guī)律不同，NAB2在損傷后4h時表達(dá)開始增強(qiáng)（P0.05），持續(xù)表達(dá)到缺氧1d，表達(dá)時相晚于Egr-1蛋白的表達(dá)。EMSA顯示缺血缺氧損傷后As中Egr-1核蛋白與bFGF WP=7 啟動子結(jié)合活性在4~12h升高。免疫熒光雙標(biāo)記見到在正常情況下Egr-1 蛋白和NAB2蛋白主要存在于As胞漿及核周，胞突明顯著色，細(xì)胞核內(nèi)可見微弱的表達(dá)。缺血1h后，Egr-1 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)開始增強(qiáng)，而NAB2的表達(dá)仍然主要在胞漿內(nèi)。隨著時間的延長，缺
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

左圖 1 3 泳道 DIG Egr 1 寡聚核苷酸探針對照反應(yīng) 未標(biāo)記 Egr 針與 As 核蛋白的結(jié)合 DIG-Egr-1 寡聚核苷酸探針與 As 核蛋白的結(jié)合左圖 1~8 泳道分別為對照組 缺血缺氧損傷后 0.5, 1,2,4,6,12h 和 1d 組 12 EMSA 檢測持續(xù)性缺血缺氧損傷后 As 中 Egr-1 核蛋白與 bFGF 啟動子結(jié)合能 7 EMSA 檢測持續(xù)性缺血缺血缺氧損傷后 As 中 Egr-1 核蛋白與 bFGF 啟動凈灰度組序 分組 凈灰度值1 對照組 303162 缺血缺氧損傷 0.5h 411043 缺血缺氧損傷 1h 42561.474 缺血缺氧損傷 2h 499885 缺血缺氧損傷 4h 603166 缺血缺氧損傷 6h 611041 21 2

Egr 1 寡聚核苷酸探針對照反應(yīng) 未標(biāo)記 Egr G-Egr-1 寡聚核苷酸探針與 As 核蛋白的結(jié)合照組 缺血缺氧損傷后 0.5, 1,2,4,6,12h 和 1d 組缺氧損傷后 As 中 Egr-1 核蛋白與 bFGF 啟動子結(jié)合能力1 2 結(jié)合帶非 特 異帶特 異 性 條

灰度值與 a-actin 凈灰度值比值組序 分組 M E K - 1 蛋白 E R K - 1 蛋白 E R K - 2 蛋白1 對照組 1.3506±0.4334 0.3597±0.0103 0.3126±0.06762 缺氧 2h+給氧 10m 1.5967±0.6337 0.1051±0.3165* 0.1002±0.0361*3 缺氧 2h+給氧 20m 0.2178±0.1156* 0.0894±0.0160* 0.1496±0.0297*4 缺氧 2h+給氧 30m 0.1651±0.0829* 0.1088±0.0123* 0.0981±0.0075*5 缺氧 2h+給氧 1h 0.2104±0.1223* 0.1906±0.1629* 0.1968±0.0198*6 缺氧 2h+給氧 2h 0.2706±0.1261* 0.1875±0.0164* 0.1574±0.0099*7 缺氧 2h+給氧 4h 1.3373±0.4206 0.4163±0.0507 0.3490±0.03838 缺氧 2h+給氧 6h 1.3650±0.516 0.4698±0.0647 0.3966±0.00699 缺氧 2h+給氧 12h 0.8081±0.0699 0.5597±0.0965 0.4131±0.062710 缺氧 2h+給氧 1d 1.003±0.1873 0.3446±0.0555 0.3071±0.0427注 注*者表明與對照組比較具有明顯差異 p<0.05
【引證文獻(xiàn)】

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1 李宜航;西洋參莖葉皂苷對大鼠缺血腦組織IL-6和bFGF含量的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2010年

本文編號：2891535