本文關(guān)鍵詞：MiR-918的加工調(diào)節(jié)機(jī)制及其在紅系分化中的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：造血過程是人體內(nèi)各類血細(xì)胞的發(fā)育、成熟的過程。整個(gè)造血分化過程涉及到三個(gè)階段：第一個(gè)階段是造血干細(xì)胞（hemopietic stem cells）階段，這些造血干細(xì)胞能通過自我復(fù)制（self renewal）保持自身數(shù)量的穩(wěn)定，同時(shí)又可以分化發(fā)育形成各系的定向祖細(xì)胞（committedprogenitors）；第二個(gè)階段是定向祖細(xì)胞階段，這個(gè)階段包括紅系祖細(xì)胞（CFU-E）、巨核系祖細(xì)胞（CFU-MK）、粒-單核系祖細(xì)胞（CFU-GM），和TB淋巴系祖細(xì)胞（CFU-TB）；第三個(gè)階段是前體細(xì)胞（precursors）及其成熟階段，這一階段的細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟為具有各類特殊功能的終末血細(xì)胞，然后釋放進(jìn)入外周血液。紅系分化是體內(nèi)造血分化過程的重要分支。 miRNAs是一類具有18-25個(gè)核苷酸、非編碼的微小調(diào)節(jié)性的RNA分子，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與生命調(diào)控的各個(gè)方面，并與多種疾病的產(chǎn)生相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)microRNAs（miRNAs）也參與了紅系分化的調(diào)控過程。 目的:本論文主要研究miR-918的加工調(diào)節(jié)以及在紅系分化中的作用機(jī)制。 方法：利用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）篩選了一批與紅系分化相關(guān)的miRNA,分別針對(duì)這些miRNA的primary、precusor、mature形式設(shè)計(jì)引物，用以檢測(cè)在氯化血紅素（hemin）誘導(dǎo)的K562細(xì)胞向紅系分化過程中的表達(dá)變化，收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，確定miR-918在紅系分化的表達(dá)變化。通過5，-race實(shí)驗(yàn)和3，-race實(shí)驗(yàn)獲得pri-918的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步利用RBPDB軟件隊(duì)pri-918全長(zhǎng)進(jìn)行分析，將候選RNA結(jié)合蛋白的si-RNA轉(zhuǎn)染到k562細(xì)胞中，hemin誘導(dǎo)向紅系分化，利用real-time PCR方法檢測(cè)miR-918primary和mature的表達(dá)變化。利用RNA-IP、RNA-EMSA、MS2-MBP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證QKI與miR-918的結(jié)合作用。 體外合成miR-918mimic，在細(xì)胞系中進(jìn)行過表達(dá)，hemin誘導(dǎo)，用real-time PCR方法檢測(cè)γ-globin的表達(dá)變化，用流式分析紅系分化的表面標(biāo)記CD235a/CD71的表達(dá)表達(dá)。隨后在臍帶血來源的CD34+干細(xì)胞中利用慢病毒進(jìn)行miR-918的過表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相應(yīng)變化。進(jìn)一步構(gòu)建可以降低QKI-5表達(dá)的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，檢測(cè)r-globin的變化和紅系分化表面標(biāo)記的變化。 利用軟件分析，找到miR-918的若干候選靶基因，將這些候選基因3’UTR區(qū)包含miRNA結(jié)合位點(diǎn)的序列克隆入熒光素酶報(bào)告基因的下游，與miR-918mimic共轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞后檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，采用雙熒光實(shí)驗(yàn)和western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這些靶基因。 結(jié)果：miR-918在紅系分化過程中有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNA結(jié)合蛋白QKI-5和miR-918存在直接作用；過表達(dá)miR-918，使得hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞中血紅蛋白合成受阻，紅系分化標(biāo)志CD235a/CD71受到顯著抑制，表明miR-918抑制紅系分化。在原代培養(yǎng)的CD34+干細(xì)胞中過表達(dá)miR-918得到的結(jié)果與上述細(xì)胞系中一致。而且，抑制K562細(xì)胞中QKI-5表達(dá)后促進(jìn)紅系分化，表明QKI參與miR-918的加工成熟。 雙熒光實(shí)驗(yàn)表明包含有TAL1和c MYB基因3’UTR的報(bào)告基因的表達(dá)可以被miR-918明顯抑制；突變相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)序列，這種抑制作用消失。Western blot也證實(shí)在K562細(xì)胞中過表達(dá)miR-918， TAL1和c MYB蛋白的水平明顯降低。上述結(jié)果表明TAL1和c-MYB是miR-918的直接靶基因，miR-918在紅系分化中的調(diào)控機(jī)制可能是通過TAL1和c-MYB來實(shí)現(xiàn)。 結(jié)論：1、RNA結(jié)合蛋白QKI-5促進(jìn)miR-918的加工成熟； 2、微小RNA miR-918抑制紅系分化； 3、c-MYB和TAL1是miR-918在紅系分化中的靶基因。
【關(guān)鍵詞】：miR-918 紅系分化 QKI-5 c-MYB TAL1
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R331.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 引言13-17
• 1 實(shí)驗(yàn)材料17-21
• 1.1 酶制品和分子量 Marker17
• 1.2. 主要生化試劑17
• 1.3. 培養(yǎng)基、血清及抗生素17-18
• 1.4. 細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子18
• 1.5. 試劑盒18
• 1.6. 菌株18
• 1.7. 質(zhì)粒18
• 1.8. 細(xì)胞系18
• 1.9. 人臍帶血標(biāo)本18-19
• 1.10. 生物信息學(xué)分析軟件19
• 1.11. 主要儀器及設(shè)備19-21
• 2 實(shí)驗(yàn)方法21-39
• 2.1. 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)21-22
• 2.1.1 細(xì)胞系的培養(yǎng)21
• 2.1.2 細(xì)胞系的誘導(dǎo)21
• 2.1.3 細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染21-22
• 2.2. 造血干細(xì)胞的體外培養(yǎng)22-23
• 2.2.1 人臍帶血標(biāo)本的收集22
• 2.2.2 單個(gè)核細(xì)胞的分離和純化22-23
• 2.2.3 CD34+造血干/祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)紅系分化23
• 2.2.4 流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)細(xì)胞表面分化 maker23
• 2.3. Real time PCR23-25
• 2.3.1 TRIZOl 法提取細(xì)胞總 RNA23-24
• 2.3.2 RNA 質(zhì)量的檢測(cè)24
• 2.3.3 M-MLV 合成 cDNA 第一鏈24-25
• 2.4. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建25
• 2.5. 質(zhì)粒 DNA 的提取25-26
• 2.5.1 質(zhì)粒 DNA 的小量提取和定量25-26
• 2.6. 質(zhì)粒 DNA 的大量制備及純化26-27
• 2.7. 慢病毒的包裝27
• 2.7.1 慢病毒的包裝和收獲27
• 2.7.2 慢病毒的濃縮27
• 2.7.3 慢病毒感染目的細(xì)胞27
• 2.8. Western blot27-29
• 2.8.1 蛋白的提取及定量27-28
• 2.8.2 蛋白的 SDS-PAGE 電泳28
• 2.8.3 蛋白電轉(zhuǎn)移28
• 2.8.4 雜交28
• 2.8.5 二次免疫印跡28-29
• 2.9. 雙螢光報(bào)告實(shí)驗(yàn)29
• 2.10. RNA EMSA 實(shí)驗(yàn)29-30
• 2.10.1 樣品的制備29
• 2.10.2 制備-PAGE 電泳29
• 2.10.3 蛋白的電轉(zhuǎn)移29-30
• 2.10.4 紫外交聯(lián)30
• 2.10.5 雜交30
• 2.11. RNA IP(RNA Binding protein immunoprecipitation) 實(shí)驗(yàn)30-32
• 2.11.1 制備抗體包被的 protein A30
• 2.11.2 裂解細(xì)胞30-32
• 2.12. MS2 MBP 實(shí)驗(yàn)32-33
• 2.13. 5， race 實(shí)驗(yàn)33-36
• 2.13.1 磷酸化處理33
• 2.13.2 “去帽子”反應(yīng)-使用 Tobacco Acid pyrophospharase（TAP）去掉 m RNA 的 5，帽子，保留一個(gè)磷酸集團(tuán)33-34
• 2.13.3 5，-Race Adapter 連接34
• 2.13.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按下列體系加入：34-35
• 2.13.5 outer PCR 反應(yīng)35
• 2.13.6 inner PCR 反應(yīng)35-36
• 2.14. 3,-Race 實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.14.1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系如下：36
• 2.14.2 套式 PCR 反應(yīng)36-37
• 2.14.3 inner PCR 反應(yīng)37
• 2.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37-39
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-51
• 3.1. 紅系分化中 miRNA 的表達(dá)檢測(cè)39-43
• 3.1.1 MiR-918 與紅系分化相關(guān)39-40
• 3.1.2 pri-918 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的獲得40
• 3.1.3 QKI-5 促進(jìn) miR-918 的加工40-41
• 3.1.4 RNA IP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 QKI 5 和 miR 918 的結(jié)合41-42
• 3.1.5 RNA EMSA 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 QKI 5 和 miR 918 的直接結(jié)合42-43
• 3.1.6 MS2-MBP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 QKI-5 和 miR-918 的結(jié)合43
• 3.2. miR 918 在紅系分化過程中的功能研究43-47
• 3.2.1 miR-918 基因結(jié)構(gòu)分析43-44
• 3.2.2 miR-918 在紅系分化中的表達(dá)44-45
• 3.2.2.1 hemin 誘導(dǎo) K562 細(xì)胞向紅系分化44
• 3.2.2.2 定向誘導(dǎo) CD34+向紅系分化44-45
• 3.2.3 miR 918 在紅系分化中的功能45-47
• 3.2.3.1 過表達(dá) miR-918 對(duì) K562 的影響45-46
• 3.2.3.2 過表達(dá) miR-918 對(duì) CD34+造血干細(xì)胞分化的影響46-47
• 3.3. QKI 5 在紅系分化中的功能研究47-48
• 3.3.1 QKI-5 在 K562 紅系分化中的功能47-48
• 3.4. miR 918 作用于紅系分化的分子機(jī)制研究48-51
• 3.4.1 miR-918 靶基因的預(yù)測(cè)和初步驗(yàn)證48-49
• 3.4.2 miR-918 靶基因的突變位點(diǎn)分析49
• 3.4.3 miR-918 靶基因的 western blot 驗(yàn)證49-51
• 4 結(jié)論51-53
• 5 討論53-57
• 5.1 在細(xì)胞核中 miRNA 的生物起源和加工過程53-54
• 5.2 miRNAs 在細(xì)胞質(zhì)的加工過程54
• 5.3 紅系分化中重要的轉(zhuǎn)錄因子54-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 文獻(xiàn)綜述63-75
• 參考文獻(xiàn)71-75
• 致謝75-76
• 攻讀碩士期間發(fā)表和待發(fā)表的學(xué)術(shù)論文76-77

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 胡欣春;魏益平;彭金華;喻東亮;徐建軍;;miR-4686對(duì)A549細(xì)胞球增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年04期

2 傅軍;吳雪英;王守銘;;微小RNA與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進(jìn)展[J];福建醫(yī)藥雜志;2014年01期

3 董寧;葛高霞;張煒明;朱偉;徐華國(guó);;XIAP基因3′非翻譯區(qū)熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及活性分析[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2014年09期

4 劉莎;孫國(guó)平;;miRNA145作為抑癌基因在胃癌中的表達(dá)及其功能研究[J];安徽醫(yī)藥;2014年10期

5 聶靜;吳正升;朱敬鳳;黃山;吳強(qiáng);;Has-miR-339-5p對(duì)裸小鼠人乳腺癌移植瘤形成及生長(zhǎng)的影響[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2014年03期

6 車艷紅;盧愛妮;廖予妹;;miR-143在宮頸癌組織中表達(dá)及臨床意義的初步研究[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2014年05期

7 王琳;婁加陶;;microRNA-128a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年03期

8 朱迎;陳妍珂;董健;王曉霏;呂毅;程繼文;;miR-519在腫瘤中的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2014年04期

9 吳雄輝;余祖虎;賀蓉;倪梁朝;桂耀庭;楊尚琪;來永慶;;腎癌中miR-142-3p表達(dá)分析及臨床意義研究[J];現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志;2014年02期

10 胡曉薇;劉丹;王金彩;劉文濤;楊玉光;吳瑾;;miRNA-105在胃癌組織中的表達(dá)情況[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年16期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 郭繼剛;microRNA在神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移及骨肉瘤發(fā)生過程中的研究[D];南京大學(xué);2011年

2 白立景;豬骨骼肌發(fā)育中相關(guān)miRNA的鑒定及miR-21生物學(xué)功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 張茁;miRNA介導(dǎo)選擇性表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)[D];吉林大學(xué);2014年

4 陸洋;MiR-200a對(duì)人胰腺癌干細(xì)胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及體外生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2014年

5 孫允霄;順鉑通過miR-16下調(diào)BDNF表達(dá)抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的研究[D];山東大學(xué);2014年

6 陳佳佳;基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)信息學(xué)[D];蘇州大學(xué);2013年

7 王翠萍;hsa-miR-483-3p在胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)及功能的初步研究及對(duì)腎上腺皮質(zhì)腫瘤診斷和預(yù)后的意義研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

8 郭瓊;miR-375及MTDH在前列腺癌細(xì)胞中的功能研究[D];中南大學(xué);2013年

9 陳曉宇;不同病理類型膠質(zhì)瘤標(biāo)本MiRNA表達(dá)譜分析及MiR-125a-5p在GBM中生物學(xué)功能的研究[D];中南大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李勉;miR-222、miR-125b與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤臨床、病理及預(yù)后的關(guān)系[D];華中科技大學(xué);2013年

2 陳宏偉;MiRNA-34a在宮頸癌組織中的表達(dá)及調(diào)控[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2013年

3 唐志斌;姜黃素上調(diào)miR-124抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖和侵襲的機(jī)制研究[D];南華大學(xué);2012年

4 李利廷;結(jié)直腸癌中microRNA-150的表達(dá)與p21、p27的關(guān)系及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

5 張?jiān)蚂o;miR-21-4T1細(xì)胞的構(gòu)建及其exosome功能的初步研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

6 楊偉瓊;miR-30d通過自噬調(diào)控影響未分化型甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑治療敏感性的研究[D];蘇州大學(xué);2014年

7 沈旦;MiR-205調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2014年

8 張寧;MiR-342在肝癌組織中過度表達(dá)的研究[D];山東大學(xué);2014年

9 趙明;MiRNA137和miRNA29a在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[D];南京大學(xué);2012年

10 段衛(wèi)明;SATB1與相關(guān)MicroRNA在乳腺癌中的表達(dá)研究[D];蘇州大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：MiR-918的加工調(diào)節(jié)機(jī)制及其在紅系分化中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：288968