本文關鍵詞：MiR-918的加工調節(jié)機制及其在紅系分化中的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：造血過程是人體內各類血細胞的發(fā)育、成熟的過程。整個造血分化過程涉及到三個階段：第一個階段是造血干細胞（hemopietic stem cells）階段，這些造血干細胞能通過自我復制（self renewal）保持自身數(shù)量的穩(wěn)定，同時又可以分化發(fā)育形成各系的定向祖細胞（committedprogenitors）；第二個階段是定向祖細胞階段，這個階段包括紅系祖細胞（CFU-E）、巨核系祖細胞（CFU-MK）、粒-單核系祖細胞（CFU-GM），和TB淋巴系祖細胞（CFU-TB）；第三個階段是前體細胞（precursors）及其成熟階段，這一階段的細胞進一步分化成熟為具有各類特殊功能的終末血細胞，然后釋放進入外周血液。紅系分化是體內造血分化過程的重要分支。 miRNAs是一類具有18-25個核苷酸、非編碼的微小調節(jié)性的RNA分子，主要在轉錄后水平調控基因的表達，參與生命調控的各個方面，并與多種疾病的產生相關。研究發(fā)現(xiàn)microRNAs（miRNAs）也參與了紅系分化的調控過程。 目的:本論文主要研究miR-918的加工調節(jié)以及在紅系分化中的作用機制。 方法：利用實時定量PCR（real-time PCR）篩選了一批與紅系分化相關的miRNA,分別針對這些miRNA的primary、precusor、mature形式設計引物，用以檢測在氯化血紅素（hemin）誘導的K562細胞向紅系分化過程中的表達變化，收集不同時間點的細胞，確定miR-918在紅系分化的表達變化。通過5，-race實驗和3，-race實驗獲得pri-918的全長轉錄本，進一步利用RBPDB軟件隊pri-918全長進行分析，將候選RNA結合蛋白的si-RNA轉染到k562細胞中，hemin誘導向紅系分化，利用real-time PCR方法檢測miR-918primary和mature的表達變化。利用RNA-IP、RNA-EMSA、MS2-MBP實驗驗證QKI與miR-918的結合作用。 體外合成miR-918mimic，在細胞系中進行過表達，hemin誘導，用real-time PCR方法檢測γ-globin的表達變化，用流式分析紅系分化的表面標記CD235a/CD71的表達表達。隨后在臍帶血來源的CD34+干細胞中利用慢病毒進行miR-918的過表達，用流式細胞術檢測相應變化。進一步構建可以降低QKI-5表達的質粒，轉染K562細胞，檢測r-globin的變化和紅系分化表面標記的變化。 利用軟件分析，找到miR-918的若干候選靶基因，將這些候選基因3’UTR區(qū)包含miRNA結合位點的序列克隆入熒光素酶報告基因的下游，與miR-918mimic共轉染293TN細胞后檢測報告基因的表達情況，采用雙熒光實驗和western blot實驗進一步驗證這些靶基因。 結果：miR-918在紅系分化過程中有表達，實驗證實RNA結合蛋白QKI-5和miR-918存在直接作用；過表達miR-918，使得hemin誘導的K562細胞中血紅蛋白合成受阻，紅系分化標志CD235a/CD71受到顯著抑制，表明miR-918抑制紅系分化。在原代培養(yǎng)的CD34+干細胞中過表達miR-918得到的結果與上述細胞系中一致。而且，抑制K562細胞中QKI-5表達后促進紅系分化，表明QKI參與miR-918的加工成熟。 雙熒光實驗表明包含有TAL1和c MYB基因3’UTR的報告基因的表達可以被miR-918明顯抑制；突變相應的結合位點序列，這種抑制作用消失。Western blot也證實在K562細胞中過表達miR-918， TAL1和c MYB蛋白的水平明顯降低。上述結果表明TAL1和c-MYB是miR-918的直接靶基因，miR-918在紅系分化中的調控機制可能是通過TAL1和c-MYB來實現(xiàn)。 結論：1、RNA結合蛋白QKI-5促進miR-918的加工成熟； 2、微小RNA miR-918抑制紅系分化； 3、c-MYB和TAL1是miR-918在紅系分化中的靶基因。
【關鍵詞】：miR-918 紅系分化 QKI-5 c-MYB TAL1
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R331.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 引言13-17
• 1 實驗材料17-21
• 1.1 酶制品和分子量 Marker17
• 1.2. 主要生化試劑17
• 1.3. 培養(yǎng)基、血清及抗生素17-18
• 1.4. 細胞因子和生長因子18
• 1.5. 試劑盒18
• 1.6. 菌株18
• 1.7. 質粒18
• 1.8. 細胞系18
• 1.9. 人臍帶血標本18-19
• 1.10. 生物信息學分析軟件19
• 1.11. 主要儀器及設備19-21
• 2 實驗方法21-39
• 2.1. 細胞學實驗21-22
• 2.1.1 細胞系的培養(yǎng)21
• 2.1.2 細胞系的誘導21
• 2.1.3 細胞系的轉染21-22
• 2.2. 造血干細胞的體外培養(yǎng)22-23
• 2.2.1 人臍帶血標本的收集22
• 2.2.2 單個核細胞的分離和純化22-23
• 2.2.3 CD34+造血干/祖細胞體外誘導紅系分化23
• 2.2.4 流式細胞術(FACS)檢測細胞表面分化 maker23
• 2.3. Real time PCR23-25
• 2.3.1 TRIZOl 法提取細胞總 RNA23-24
• 2.3.2 RNA 質量的檢測24
• 2.3.3 M-MLV 合成 cDNA 第一鏈24-25
• 2.4. 重組質粒的構建25
• 2.5. 質粒 DNA 的提取25-26
• 2.5.1 質粒 DNA 的小量提取和定量25-26
• 2.6. 質粒 DNA 的大量制備及純化26-27
• 2.7. 慢病毒的包裝27
• 2.7.1 慢病毒的包裝和收獲27
• 2.7.2 慢病毒的濃縮27
• 2.7.3 慢病毒感染目的細胞27
• 2.8. Western blot27-29
• 2.8.1 蛋白的提取及定量27-28
• 2.8.2 蛋白的 SDS-PAGE 電泳28
• 2.8.3 蛋白電轉移28
• 2.8.4 雜交28
• 2.8.5 二次免疫印跡28-29
• 2.9. 雙螢光報告實驗29
• 2.10. RNA EMSA 實驗29-30
• 2.10.1 樣品的制備29
• 2.10.2 制備-PAGE 電泳29
• 2.10.3 蛋白的電轉移29-30
• 2.10.4 紫外交聯(lián)30
• 2.10.5 雜交30
• 2.11. RNA IP(RNA Binding protein immunoprecipitation) 實驗30-32
• 2.11.1 制備抗體包被的 protein A30
• 2.11.2 裂解細胞30-32
• 2.12. MS2 MBP 實驗32-33
• 2.13. 5， race 實驗33-36
• 2.13.1 磷酸化處理33
• 2.13.2 “去帽子”反應-使用 Tobacco Acid pyrophospharase（TAP）去掉 m RNA 的 5，帽子，保留一個磷酸集團33-34
• 2.13.3 5，-Race Adapter 連接34
• 2.13.4 反轉錄反應，按下列體系加入：34-35
• 2.13.5 outer PCR 反應35
• 2.13.6 inner PCR 反應35-36
• 2.14. 3,-Race 實驗36-37
• 2.14.1 反轉錄反應，體系如下：36
• 2.14.2 套式 PCR 反應36-37
• 2.14.3 inner PCR 反應37
• 2.15 統(tǒng)計學分析37-39
• 3 實驗結果39-51
• 3.1. 紅系分化中 miRNA 的表達檢測39-43
• 3.1.1 MiR-918 與紅系分化相關39-40
• 3.1.2 pri-918 全長轉錄本的獲得40
• 3.1.3 QKI-5 促進 miR-918 的加工40-41
• 3.1.4 RNA IP 實驗驗證 QKI 5 和 miR 918 的結合41-42
• 3.1.5 RNA EMSA 實驗驗證 QKI 5 和 miR 918 的直接結合42-43
• 3.1.6 MS2-MBP 實驗驗證 QKI-5 和 miR-918 的結合43
• 3.2. miR 918 在紅系分化過程中的功能研究43-47
• 3.2.1 miR-918 基因結構分析43-44
• 3.2.2 miR-918 在紅系分化中的表達44-45
• 3.2.2.1 hemin 誘導 K562 細胞向紅系分化44
• 3.2.2.2 定向誘導 CD34+向紅系分化44-45
• 3.2.3 miR 918 在紅系分化中的功能45-47
• 3.2.3.1 過表達 miR-918 對 K562 的影響45-46
• 3.2.3.2 過表達 miR-918 對 CD34+造血干細胞分化的影響46-47
• 3.3. QKI 5 在紅系分化中的功能研究47-48
• 3.3.1 QKI-5 在 K562 紅系分化中的功能47-48
• 3.4. miR 918 作用于紅系分化的分子機制研究48-51
• 3.4.1 miR-918 靶基因的預測和初步驗證48-49
• 3.4.2 miR-918 靶基因的突變位點分析49
• 3.4.3 miR-918 靶基因的 western blot 驗證49-51
• 4 結論51-53
• 5 討論53-57
• 5.1 在細胞核中 miRNA 的生物起源和加工過程53-54
• 5.2 miRNAs 在細胞質的加工過程54
• 5.3 紅系分化中重要的轉錄因子54-57
• 參考文獻57-63
• 文獻綜述63-75
• 參考文獻71-75
• 致謝75-76
• 攻讀碩士期間發(fā)表和待發(fā)表的學術論文76-77

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：MiR-918的加工調節(jié)機制及其在紅系分化中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：288968