金黃色葡萄球菌是一種非常重要的人體致病菌,可以引發(fā)一系列疾病,從普通的皮膚類感染疾病,如丘疹、膿皰病、疔瘡、燙傷樣皮膚綜合癥,到可以致死的系統(tǒng)性感染疾病如肺炎、腦膜炎、骨髓炎、中毒性休克綜合癥以及敗血癥等。金黃色葡萄球菌之所以能成為重要致病菌并引發(fā)如此眾多的疾病感染,主要原因在于可以表達和分泌大量的毒性因子。這些毒性因子主要包括分泌型蛋白:絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶、核酸酶、溶血素、腸毒素、脂肪酶、凝固酵素,和細胞表面蛋白:蛋白質(zhì)A(protein A),纖維蛋白原/膠原質(zhì)-連接蛋白等。 近年來,3’,5’-環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)信號分子調(diào)控系統(tǒng)受到越來越多的關注。c-di-GMP最早作為木葡糖醋酸桿菌纖維素合成酶的別構激活子被發(fā)現(xiàn),目前已被認定為廣泛存在于細菌當中的第二信使信號分子,參與多種復雜的生理活動的調(diào)控。c-di-GMP是由一系列含有GGDEF結構域的蛋白合成并由含有EAL或者HD-GYP結構域的蛋白降解。盡管在很多細菌當中c-di-GMP做為第二信使行使功能已經(jīng)被深入的研究,但是在一些低GC含量的革蘭氏陽性細菌當中,c-di-GMP究竟扮演什么樣的角色需要更多的研究來揭示。 全基因組測序信息顯示金黃色葡萄球菌的基因組只編碼了一個GGDEF結構域蛋白(GdpS),而沒有EAL或者HD-GYP結構域的蛋白。本研究采用生物基因芯片、實時熒光定量PCR等技術比較野生型金黃色葡萄球標準菌株NCTC8325與其gdpS基因敲除株的基因表達差異。結果顯示金黃色葡萄球菌中唯一的GGDEF結構域蛋白(GdpS)影響了一些毒性基因的表達。在gdpS基因敲除株中,一系列毒性因子的轉錄水平發(fā)生了變化,例如絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶、纖維蛋白原連接蛋白,尤其是蛋白A(protein A,Spa)。蛋白A是金黃色葡萄球菌中的一種重要的胞壁蛋白,可以和多種哺乳動物的免疫球蛋白IgG的Fc端結合并被認為是金黃色葡萄球菌免疫逃避機制的重要組成元件,蛋白A的致病性已通過多種動物模型得到證實�；诘鞍譇的重要性,本研究對GdpS影響其表達的機制進行了更深入的探求。在gdpS敲除株中,編碼蛋白A的基因spa的轉錄水平降低了約8倍。有趣的是,spa的一個正調(diào)控因子sarS的轉錄水平在gdpS敲除株中也有所下降,表明gdpS影響spa的表達可能通過sarS。為了證明這一點,我們在gdpS敲除株中轉入含有編碼全長gdpS的序列的互補質(zhì)粒,結果發(fā)現(xiàn)spa和sarS的轉錄水平被都回補到了野生型的水平。而另一方面,同樣作為spa表達的調(diào)節(jié)因子的agr、sarA、sarT和rot的轉錄水平在gdpS敲除株中則沒有變化。因此,可以得出結論:gdpS影響spa的表達通過sarS而不依賴于agr、sarA、sarT、和rot。此外,互補實驗的結果表明GdpS影響spa的表達依賴于其N-端結構域,而不依賴其C-端的GGDEF結構域,即GdpS影響spa的表達不依賴于c-di-GMP信號通路。
【學位單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R378
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 金黃色葡萄球菌概述
        1.1.1 引言
        1.1.2 生物學特性
        1.1.3 流行病學
        1.1.4 致病性
        1.1.5 金黃色葡萄球菌的致病過程
            1.1.5.1 引言
            1.1.5.2 金黃色葡萄球菌的侵襲過程
            1.1.5.3 金黃色葡萄球菌的侵襲后過程
    1.2 金黃色葡萄球菌毒性因子
        1.2.1 引言
        1.2.2 分泌型毒力因子
            1.2.2.1 凝固酶
            1.2.2.2 腸毒素
            1.2.2.3 殺白細胞素
            1.2.2.4 蛋白酶
            1.2.2.5 毒力因子的分泌機制
        1.2.3 細胞壁毒力蛋白
            1.2.3.1 引言
            1.2.3.2 ECMBP 的結構概述
            1.2.3.3 識別纖連蛋白的 FnBP
            1.2.3.4 識別膠原蛋白的 Cna
            1.2.3.5 識別纖維蛋白原的 ClfA
            1.2.3.6 蛋白 A
        1.2.4 金黃色葡萄球菌和生物膜
            1.2.4.1 引言
            1.2.4.2 PIA
            1.2.4.3 與細菌黏附力有關的細菌產(chǎn)物
            1.2.4.4 金黃色葡萄球菌的自溶素
    1.3 金黃色葡萄球菌毒性因子調(diào)控機制
        1.3.1 引言
        1.3.2 雙組分信號系統(tǒng)
        1.3.3 附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng) Agr
        1.3.4 胞外蛋白表達調(diào)控系統(tǒng) Sae
        1.3.5 自溶相關的調(diào)控系統(tǒng) ArlSR
        1.3.6 LytRS
        1.3.7 輔助蛋白調(diào)控系統(tǒng)SarA（Staphylocccus aureus accessory regulator A） 及其同源物SarT,SarS,Rot
        1.3.8 毒性基因 spa 的表達調(diào)控網(wǎng)絡
    1.4 cdiGMP 作為第二信使的功能介紹
        1.4.1 引言
        1.4.2 C-di-GMP 的合成和降解
        1.4.3 GGDEF 和 EAL 結構域蛋白在細菌中的分布
        1.4.4 GGDEF 和 EAL 結構域蛋白的組成
        1.4.5 c-di-GMP 的調(diào)控行為
        1.4.6 葡萄球菌中的c-di-GMP 的研究
第2章 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗菌株及載體
        2.1.2 實驗所用引物
        2.1.3 實驗所用試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 大腸桿菌化轉感受態(tài)的制備
        2.2.2 大腸桿菌化轉
        2.2.3 金黃色葡萄球菌電轉感受態(tài)的制備
        2.2.4 金黃色葡萄球菌電轉
        2.2.5 金黃色葡萄球菌基因組 DNA 的提取
        2.2.6 質(zhì)粒的構建
            2.2.6.1 同源重組質(zhì)粒的構建
            2.2.6.2 互補質(zhì)粒的構建
        2.2.7 gdpS 突變株的構建
        2.2.8 生長曲線的測定
        2.2.9 生物膜實驗
        2.2.10 自溶實驗
        2.2.11 蛋白酶活性測定
        2.2.12 纖維連接蛋白連接實驗
        2.2.13 Western blotting
        2.2.14 金黃色葡萄球菌 RNA 抽提
        2.2.15 RNA 反轉錄實驗
        2.2.16 實時熒光定量 PCR
第3章 實驗結果和討論
    3.1 引言
    3.2 金黃色葡萄球菌中 GdpS 蛋白的生物信息學研究
    3.3 gdpS 突變株的生理實驗
    3.4 GdpS 對基因轉錄組水平的影響
    3.5 GdpS 影響 Spa 的轉錄水平通過 SarS 調(diào)控通路
    3.6 GdpS 影響spa 的轉錄依賴其 N 端結構域
    3.7 討論
參考文獻
致謝
在讀期間發(fā)表的學術論文與取得的研究成果

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 姜游帥;蜂膠對金黃色葡萄球菌毒力因子抑制作用研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學;2010年

本文編號：2888727