發(fā)布時(shí)間：2020-11-18 12:40

　　 金黃色葡萄球菌是一種非常重要的人體致病菌,可以引發(fā)一系列疾病,從普通的皮膚類感染疾病,如丘疹、膿皰病、疔瘡、燙傷樣皮膚綜合癥,到可以致死的系統(tǒng)性感染疾病如肺炎、腦膜炎、骨髓炎、中毒性休克綜合癥以及敗血癥等。金黃色葡萄球菌之所以能成為重要致病菌并引發(fā)如此眾多的疾病感染,主要原因在于可以表達(dá)和分泌大量的毒性因子。這些毒性因子主要包括分泌型蛋白:絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶、核酸酶、溶血素、腸毒素、脂肪酶、凝固酵素,和細(xì)胞表面蛋白:蛋白質(zhì)A(protein A),纖維蛋白原/膠原質(zhì)-連接蛋白等。 近年來,3’,5’-環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)信號(hào)分子調(diào)控系統(tǒng)受到越來越多的關(guān)注。c-di-GMP最早作為木葡糖醋酸桿菌纖維素合成酶的別構(gòu)激活子被發(fā)現(xiàn),目前已被認(rèn)定為廣泛存在于細(xì)菌當(dāng)中的第二信使信號(hào)分子,參與多種復(fù)雜的生理活動(dòng)的調(diào)控。c-di-GMP是由一系列含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的蛋白合成并由含有EAL或者HD-GYP結(jié)構(gòu)域的蛋白降解。盡管在很多細(xì)菌當(dāng)中c-di-GMP做為第二信使行使功能已經(jīng)被深入的研究,但是在一些低GC含量的革蘭氏陽性細(xì)菌當(dāng)中,c-di-GMP究竟扮演什么樣的角色需要更多的研究來揭示。 全基因組測序信息顯示金黃色葡萄球菌的基因組只編碼了一個(gè)GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白(GdpS),而沒有EAL或者HD-GYP結(jié)構(gòu)域的蛋白。本研究采用生物基因芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)比較野生型金黃色葡萄球標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC8325與其gdpS基因敲除株的基因表達(dá)差異。結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌中唯一的GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白(GdpS)影響了一些毒性基因的表達(dá)。在gdpS基因敲除株中,一系列毒性因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化,例如絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶、纖維蛋白原連接蛋白,尤其是蛋白A(protein A,Spa)。蛋白A是金黃色葡萄球菌中的一種重要的胞壁蛋白,可以和多種哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白IgG的Fc端結(jié)合并被認(rèn)為是金黃色葡萄球菌免疫逃避機(jī)制的重要組成元件,蛋白A的致病性已通過多種動(dòng)物模型得到證實(shí)�；诘鞍譇的重要性,本研究對(duì)GdpS影響其表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了更深入的探求。在gdpS敲除株中,編碼蛋白A的基因spa的轉(zhuǎn)錄水平降低了約8倍。有趣的是,spa的一個(gè)正調(diào)控因子sarS的轉(zhuǎn)錄水平在gdpS敲除株中也有所下降,表明gdpS影響spa的表達(dá)可能通過sarS。為了證明這一點(diǎn),我們?cè)趃dpS敲除株中轉(zhuǎn)入含有編碼全長gdpS的序列的互補(bǔ)質(zhì)粒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)spa和sarS的轉(zhuǎn)錄水平被都回補(bǔ)到了野生型的水平。而另一方面,同樣作為spa表達(dá)的調(diào)節(jié)因子的agr、sarA、sarT和rot的轉(zhuǎn)錄水平在gdpS敲除株中則沒有變化。因此,可以得出結(jié)論:gdpS影響spa的表達(dá)通過sarS而不依賴于agr、sarA、sarT、和rot。此外,互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明GdpS影響spa的表達(dá)依賴于其N-端結(jié)構(gòu)域,而不依賴其C-端的GGDEF結(jié)構(gòu)域,即GdpS影響spa的表達(dá)不依賴于c-di-GMP信號(hào)通路。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R378
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 金黃色葡萄球菌概述
        1.1.1 引言
        1.1.2 生物學(xué)特性
        1.1.3 流行病學(xué)
        1.1.4 致病性
        1.1.5 金黃色葡萄球菌的致病過程
            1.1.5.1 引言
            1.1.5.2 金黃色葡萄球菌的侵襲過程
            1.1.5.3 金黃色葡萄球菌的侵襲后過程
    1.2 金黃色葡萄球菌毒性因子
        1.2.1 引言
        1.2.2 分泌型毒力因子
            1.2.2.1 凝固酶
            1.2.2.2 腸毒素
            1.2.2.3 殺白細(xì)胞素
            1.2.2.4 蛋白酶
            1.2.2.5 毒力因子的分泌機(jī)制
        1.2.3 細(xì)胞壁毒力蛋白
            1.2.3.1 引言
            1.2.3.2 ECMBP 的結(jié)構(gòu)概述
            1.2.3.3 識(shí)別纖連蛋白的 FnBP
            1.2.3.4 識(shí)別膠原蛋白的 Cna
            1.2.3.5 識(shí)別纖維蛋白原的 ClfA
            1.2.3.6 蛋白 A
        1.2.4 金黃色葡萄球菌和生物膜
            1.2.4.1 引言
            1.2.4.2 PIA
            1.2.4.3 與細(xì)菌黏附力有關(guān)的細(xì)菌產(chǎn)物
            1.2.4.4 金黃色葡萄球菌的自溶素
    1.3 金黃色葡萄球菌毒性因子調(diào)控機(jī)制
        1.3.1 引言
        1.3.2 雙組分信號(hào)系統(tǒng)
        1.3.3 附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng) Agr
        1.3.4 胞外蛋白表達(dá)調(diào)控系統(tǒng) Sae
        1.3.5 自溶相關(guān)的調(diào)控系統(tǒng) ArlSR
        1.3.6 LytRS
        1.3.7 輔助蛋白調(diào)控系統(tǒng)SarA（Staphylocccus aureus accessory regulator A） 及其同源物SarT,SarS,Rot
        1.3.8 毒性基因 spa 的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
    1.4 cdiGMP 作為第二信使的功能介紹
        1.4.1 引言
        1.4.2 C-di-GMP 的合成和降解
        1.4.3 GGDEF 和 EAL 結(jié)構(gòu)域蛋白在細(xì)菌中的分布
        1.4.4 GGDEF 和 EAL 結(jié)構(gòu)域蛋白的組成
        1.4.5 c-di-GMP 的調(diào)控行為
        1.4.6 葡萄球菌中的c-di-GMP 的研究
第2章 實(shí)驗(yàn)材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及載體
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)所用引物
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)所用試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 大腸桿菌化轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備
        2.2.2 大腸桿菌化轉(zhuǎn)
        2.2.3 金黃色葡萄球菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備
        2.2.4 金黃色葡萄球菌電轉(zhuǎn)
        2.2.5 金黃色葡萄球菌基因組 DNA 的提取
        2.2.6 質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.6.1 同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.6.2 互補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.7 gdpS 突變株的構(gòu)建
        2.2.8 生長曲線的測定
        2.2.9 生物膜實(shí)驗(yàn)
        2.2.10 自溶實(shí)驗(yàn)
        2.2.11 蛋白酶活性測定
        2.2.12 纖維連接蛋白連接實(shí)驗(yàn)
        2.2.13 Western blotting
        2.2.14 金黃色葡萄球菌 RNA 抽提
        2.2.15 RNA 反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)
        2.2.16 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR
第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
    3.1 引言
    3.2 金黃色葡萄球菌中 GdpS 蛋白的生物信息學(xué)研究
    3.3 gdpS 突變株的生理實(shí)驗(yàn)
    3.4 GdpS 對(duì)基因轉(zhuǎn)錄組水平的影響
    3.5 GdpS 影響 Spa 的轉(zhuǎn)錄水平通過 SarS 調(diào)控通路
    3.6 GdpS 影響spa 的轉(zhuǎn)錄依賴其 N 端結(jié)構(gòu)域
    3.7 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的研究成果

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 姜游帥;蜂膠對(duì)金黃色葡萄球菌毒力因子抑制作用研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2888727